開博通和氯沙坦對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)Wista大鼠血管平滑肌細(xì)胞bcl-2和Fas基因表達(dá)的抑制作用.pdf

1、背景和目的:
　　 自從十九世紀(jì)末腎素發(fā)現(xiàn)以來,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)對(duì)腎素血管緊張素系統(tǒng)(reninangiotensin system,RAS)的認(rèn)識(shí)和研究已經(jīng)經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)。RAS作為心血管系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因素,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis disease,AS)疾病的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。眾所周知,AS疾病的主要危險(xiǎn)因素有高血壓、糖尿病、以胰島素抵抗為特征的代謝綜合征等,而RAS系統(tǒng)的激活在上述危險(xiǎn)因素的發(fā)生、

2、發(fā)展中扮演著重要的作用。在上述疾病中由血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmooth muscle cells,VSMC)增殖與凋亡參與的血管重構(gòu)促進(jìn)了病程的進(jìn)展。
　　 血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)是RAS系統(tǒng)的一個(gè)主要活性成分,AngⅡ通過其1型(angiotensin 1,AT1)受體發(fā)揮其對(duì)心血管系統(tǒng)的作用。局部血管的RAS能直接影響血管的功能狀態(tài)以及內(nèi)皮細(xì)胞功能,造成VSMC的增殖和肥大,從而導(dǎo)致

3、了高血壓、AS疾病的血管重構(gòu)。AngⅡ能促進(jìn)原癌基因和多種生長因子和其它激素如內(nèi)皮素(endothelin,ET)的mRNA表達(dá),使VSMC增殖、肥大及細(xì)胞間基質(zhì)增加。反過來,AngⅡ也可以通過上調(diào)一氧化氮合酶(nitricoxide synthase,NOS)的mRNA表達(dá),一氧化氮能使血管平滑肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)降低,而使Bax、P53和Fas表達(dá)升高,這些結(jié)果進(jìn)一步證明了AngⅡ能介導(dǎo)VSMC的凋亡,抑制VSMC生長。但在高血壓

4、、糖尿病及代謝綜合征患者體內(nèi),促生長因子和生長抑制因子兩者間的平衡關(guān)系被打破,此時(shí)VSMC表現(xiàn)為肥大和增殖,并且對(duì)體內(nèi)的血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性升高,導(dǎo)致血管壁增厚。細(xì)胞凋亡過程是多種調(diào)節(jié)基因參加的復(fù)雜的分子水平調(diào)節(jié)機(jī)制,目前為止研究較多的和平滑肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因有Bcl-2、p53、c-myc、fas等,上述基因各自通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路影響細(xì)胞的凋亡過程。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬研究這兩種RAS阻滯劑在拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的Wista大鼠

5、VSMC凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Fas表達(dá)方面的作用,從而探討這兩種藥物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC平滑肌細(xì)胞增殖的作用。
　　 RAS在AS相關(guān)疾病患者中均有不同程度的激活,該系統(tǒng)的阻斷劑是目前AS相關(guān)疾病臨床治療的基礎(chǔ)藥物,RAS的阻滯劑腎素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensinconverting enzyme inhibitor,ACEI)及AT1受體拮抗劑主要是以拮抗AngⅡ的生理作用而發(fā)揮其治療作用的。目前RAS

6、系統(tǒng)阻斷劑藥物的臨床研究主要局限于其對(duì)血壓的控制和對(duì)心臟重構(gòu)的影響方面,而關(guān)于RAS系統(tǒng)與血管平滑肌細(xì)胞增生肥大導(dǎo)致的血管重構(gòu)及其干預(yù)因的研究尚且不多,本課題研究了AngⅡ?qū)ista大鼠血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Fas表達(dá)的影響以及腎素血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑開博通和血管緊張素受體1拮抗劑氯沙坦對(duì)AngⅡ這一作用的干預(yù)作用,以期探索RAS阻滯劑對(duì)AS相關(guān)疾病

7、的臨床防治中更多的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)Wista大鼠胸主動(dòng)脈VSMC。
　　 1)選用雄性Wistar大鼠,斷頸處死,取其胸主動(dòng)脈原代培養(yǎng)；VSMC傳代培養(yǎng)采用常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行。傳代至5～10代,用于實(shí)驗(yàn)分組。
　　 2)取培養(yǎng)的VSMC制作半薄及超薄切片,采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色后,置于光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下觀察,并鑒定是否為目的細(xì)胞。
　　 2.將培養(yǎng)的VSMC隨機(jī)進(jìn)

8、入如下分組
　　 1)對(duì)照組VSMC用含0.5％FCS的培養(yǎng)液培養(yǎng),不加特殊試劑干預(yù)。
　　 2)按照不同AngⅡ濃度(10-8、10-7、10-6、10-5和10-4mol/L)對(duì)VSMC的影響及開博通(10-5mol/L)、氯沙坦(10-5mol/L)和上述兩藥合用(5×10-6mol/L)的干預(yù)作用分組。
　　 3)按照不同AngⅡ作用時(shí)間(12、24、48和72小時(shí))對(duì)VSMC的影響及開博通(10-5mo

9、l/L)、氯沙坦(10-5mol/L)和上述兩藥合用(5×10-6mol/L)的干預(yù)作用分組。
　　 4)應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)上述各組VSMC凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Fas的表達(dá)陽性率進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.AngⅡ、開博通和氯沙坦對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響
　　 1)給予VSMC以不同劑量AngⅡ作用后,細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)呈逐漸升高趨勢,表現(xiàn)出在一定范圍內(nèi)的劑量依賴性；除10-8mol/L組外,A

10、ngⅡ其余各濃度組Bcl-2表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；但10-4mol/L時(shí),Bcl-2表達(dá)量較10-5mol/L時(shí)有所下降；加入開博通、氯沙坦和開博通+氯沙坦干預(yù)后,Bcl-2表達(dá)量均明顯下降；與AngⅡ組比較,當(dāng)AngⅡ分別為10-7、10-6、10-5和10-4mol/L時(shí),開博通組Bcl-2表達(dá)量分別下降65.63％、54.3％、52.67％和65.01％(P<0.05或P<0.01)；氯沙坦組Bcl-2表達(dá)量分別

11、下降41.88％、32.32％、39.62％和48.25％(P<0.05或P<0.01)；開博通+氯沙坦組Bcl-2表達(dá)量分別下降54.08％、80.18％、75.33％和80.72％(均P<0.01)。其中以開博通+氯沙坦組Bcl-2表達(dá)量下降最顯著。
　　 2)AngⅡ刺激下Bcl-2的表達(dá)量亦與作用時(shí)間相關(guān),呈現(xiàn)時(shí)間依賴性,隨作用時(shí)間延長,表達(dá)量增加。作用12、24、48和72小時(shí)時(shí),Bcl-2表達(dá)量分別為6.35±1.2

12、2、35.58±5.06、38.32±5.15和40.47±5.25。與對(duì)照組比較,除12小時(shí)外,均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01)。加入開博通、氯沙坦后,Bcl-2表達(dá)量較AngⅡ組有明顯下降,其下降幅度亦具有時(shí)間依賴趨勢,其中開博通組于作用24、48和72小時(shí)分別下降54.30％、67.74％(均P<0.05)和71.6％(P<0.01)；氯沙坦組于上述三個(gè)時(shí)間分別下降32.32％、55.24％和60.31％(均P<0.05)；

13、開博通+氯沙坦組于上述三個(gè)時(shí)間分別下降80.18％、80.19％和81.76％(均P<0.01)。但開博通、氯沙坦組有隨作用時(shí)間延長,有下降幅度增大的趨勢,而開博通+氯沙坦組則無這種現(xiàn)象。
　　 2、AngⅡ、開博通和氯沙坦對(duì)Fas表達(dá)的影響
　　 1)予以不同濃度的AngⅡ(10-7、10-6、10-5和10-4mol/L)刺激VSMC 24小時(shí),Fas表達(dá)量分別為4.27±0.64、3.55±0.08、5.56±0.

14、44和6.02±0.35,與對(duì)照組比較,均顯著降低(P<0.05),但10-7mol/L以上無明顯劑量依賴性。經(jīng)開博通、氯沙坦預(yù)處理后,除AngⅡ 10-7mol/L組外,余組均增加Fas表達(dá)。與AngⅡ組比較,當(dāng)AngⅡ?yàn)?0-7、10-6、10-5和10-4Mol/L時(shí),Fas表達(dá)量于開博通組分別增加了58.66％、66.66％、54.45％和60.16％(均P<0.05)；于氯沙坦組分別增加了53.36％、59.41％、44.46

15、％和52.71(均P<0.05)；開博通+氯沙坦組分別增加了74.76％、75.95％、65.99％和70.14％(均P<0.01)。其中以開博通+氯沙坦組增加尤為顯著。
　　 2)AngⅡ刺激VSMC不同時(shí)間,除12小時(shí)組外,其余各時(shí)間組Fas表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低(P<0.05),于作用24、48和72小時(shí)時(shí)分別為4.55±0.08、4.92±0.15和4.76±0.12,無明顯時(shí)間依賴性；分別以開博通、氯沙坦及開博通+氯沙

16、坦預(yù)處理VSMC后,除12小時(shí)外,Fas表達(dá)量于24、48和72小時(shí)均較AngⅡ組顯著增加,雖有隨作用時(shí)間延長而Fas表達(dá)量增加的趨勢,但各時(shí)間組間比較無顯著性差異；其中開博通組于上述三個(gè)時(shí)間分別增加了66.66％、70.25％和73.68％(均P<0.01)；氯沙坦組分別增加了59.41％、62.86％和68.62％(均p<0.01)；開博通+氯沙坦組分別增加了73.1％、73.51％和76.46％(均p<0.01)；其中以開博通+C

17、T組增加最為顯著。
　　 結(jié)論:
　　 1.AngⅡ可以促進(jìn)Wista大鼠VSMC Bcl-2的表達(dá),并在一定范圍內(nèi)呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 2.AngⅡ可以抑制Wista大鼠VSMC Fas的表達(dá),但并未發(fā)現(xiàn)有明顯的劑量和時(shí)間依賴性。
　　 3.開博通、氯沙坦可以對(duì)抗AngⅡ介導(dǎo)的Wista大鼠VSMC Bcl-2表達(dá)升高,這種對(duì)抗作用在開博通+氯沙坦組更為顯著。
　　 4.開博通、氯沙坦可以

18、對(duì)抗AngⅡ介導(dǎo)的Wista大鼠VSMC Fas表達(dá)減低,這種對(duì)抗作用在開博通+氯沙坦組更為顯著。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以增加Wista大鼠血管平滑肌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá),且存在劑量和時(shí)間依賴性,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑開博通及血管緊張素1受體拮抗劑氯沙坦可拮抗AngⅡ這一作用,該結(jié)論在國內(nèi)尚未見報(bào)道。
　　 2.本研究結(jié)果顯示AngⅡ可以降低Wista大鼠血管平滑肌細(xì)胞Fas的表達(dá),且沒