深綠木霉蛋白酶基因SS42異源表達(dá)及重組蛋白生防特性分析.pdf

1、植物病害是阻礙農(nóng)業(yè)和林業(yè)增產(chǎn)的巨大難題，其中，由真菌引起的疾病占植物病害的80％，傳統(tǒng)的防治方式主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，但這對(duì)環(huán)境和人類健康都有重大影響，相比之下，生物防治會(huì)更安全些，因而被認(rèn)為是取代化學(xué)制劑的主要后備軍。據(jù)報(bào)道，一些木霉菌株具有高效的防治植物疾病的能力，而且水解酶被認(rèn)做是抵御過(guò)程中的最主要力量。深綠木霉是眾所周知生防能手，它能產(chǎn)生枯草桿菌蛋白酶(SS)，這種蛋白酶在生物防治發(fā)展中有重要的作用。
　　本研究是從生防菌株

2、深綠木霉ACCC30153中克隆出了枯草桿菌絲氨酸蛋白酶基因SS42。SS42基因中包含一個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)，編碼區(qū)全長(zhǎng)1328 bp，有三個(gè)內(nèi)含子，編碼434個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量42.55 kDa，等電點(diǎn)5.53，為疏水蛋白。BlastP結(jié)果顯示，SS42序列是Peptidases_S8_S53_superfamily家族成員，且與里氏木霉QM6a的蛋白酶相似性最高，達(dá)到98％。SignalP顯示SS42氨基酸在第

3、21和22位有一個(gè)長(zhǎng)達(dá)21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。Swissmodel軟件預(yù)測(cè)到SS42蛋白酶橢圓型的三維結(jié)構(gòu)。
　　用熒光定量RT-qPCR的方法分析九種不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的深綠木霉SS42基因的表達(dá)。九種培養(yǎng)基分別是，MM，C饑餓，N饑餓，1％山新楊莖粉，1％山新楊葉粉，1％葉枯病原菌細(xì)胞壁，5％葉枯病原菌發(fā)酵液，1％楊樹(shù)爛皮病病原菌細(xì)胞壁，5％楊樹(shù)爛皮病病原菌發(fā)酵液培養(yǎng)基。定量結(jié)果顯示在不同條件處理下，SS42基因表達(dá)均為上調(diào)狀態(tài)

4、，而且在1％葉枯病菌細(xì)胞壁培養(yǎng)下4h時(shí)表達(dá)倍數(shù)最高，是未處理時(shí)的177.29倍。綜合比較實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，深綠木霉ACCC30153菌株既能與植物也能與植物病原菌互作，且在互作過(guò)程中SS42基因可以高效表達(dá)。
　　將SS42基因與pGEX-4T-2質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)，用IPTG誘導(dǎo)異源表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)出一條清晰的條帶，大小在68 kDa，這表明重組質(zhì)粒pGEX-SS42成功導(dǎo)入了大腸桿菌，并產(chǎn)生重組蛋

5、白。用不同濃度的IPTG、不同溫度、不同時(shí)間以及不同起始OD值等條件下培養(yǎng)重組菌株，得到的表達(dá)產(chǎn)物均為包涵體蛋白，再用電純化法對(duì)蛋白進(jìn)行純化，得到清晰、單一、濃度較高的rSS42重組蛋白。
　　用福林酚法對(duì)重組蛋白酶rSS42進(jìn)行活性研究，重組蛋白酶在30-60℃，pH4-8.5條件下仍有穩(wěn)定活性。重組菌株培養(yǎng)4h時(shí)，分泌的重組蛋白表達(dá)量最高，活性最大，40℃，pH=7環(huán)境下蛋白酶活性最高為20 U/mL。
　　用深綠木霉A

6、CCC30153與五種植物病原菌（尖鐮孢菌、核盤菌、葉枯病菌、楊樹(shù)爛皮病菌、立枯絲核菌）對(duì)峙培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，木霉在生存空間、營(yíng)養(yǎng)攝取上始終占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，能不同程度的抑制病原菌的生長(zhǎng)。用重組蛋白酶rSS42對(duì)五種病原菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)表明，rSS42對(duì)病原菌抑制作用效果明顯,直觀證明了其高效的生防功能。
　　總之，深綠木霉ACCC30153菌株中的枯草桿菌絲氨酸蛋白酶SS42基因的成功獲取為蛋白質(zhì)功能和性質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ);成功表