TEV蛋白酶的優(yōu)化表達(dá)及功能分析.pdf

1、煙草蝕斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)因作用序列的專(zhuān)一性強(qiáng)廣泛用于切除融合標(biāo)簽，雖然我們之前研究的突變體TEVp5M同義突變體在大腸桿菌表達(dá)的蛋白產(chǎn)量有較大提高，但蛋白酶的活性有所下降。為進(jìn)一步改善TEVp蛋白折疊并提高其表達(dá)水平，我們結(jié)合不同方法獲得高產(chǎn)量及活性都改善的新型TEV蛋白，通過(guò)構(gòu)建融合蛋白形式，可以在相應(yīng)親和介質(zhì)酶切不同融合蛋白，獲得以下結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了3個(gè)突變體

2、。以TEVp5M同義突變體為模板，構(gòu)建3個(gè)突變體K45F、E106G和K45F/E106G。
　　2.分析TEVp突變體表達(dá)水平和活性。SDS-PAGE和蛋白印跡定性檢測(cè)和GFP熒光值定量檢測(cè)表明E106G突變體在大腸桿菌BL21(DE3)的水溶性表達(dá)水平比對(duì)照高28％，而其它兩個(gè)突變體K45F和K45/E105G低于對(duì)照。定性和定量分析TEVp酶切純化蛋白底物GST-tevS-eDAL表明，E106G突變體的切割效率比對(duì)照高32

3、%，其它兩個(gè)突變體的活性低于對(duì)照。
　　3.構(gòu)建了5個(gè)TEVpE105G融合蛋白。其N(xiāo)端分別含有標(biāo)簽MBP、GroEL、GroES或DnaK，蛋白標(biāo)簽和目的蛋白用TEVp識(shí)別序列連接，InfB(1–21)序列直接和TEVp突變體連接。
　　4.分析了融合蛋白中TEVp突變體表達(dá)水平和活性。在BL21(DE3)中，DnaK和MBP對(duì)改善TEVp突變體水溶性效果最好，而InfB(1–21)序列對(duì)促進(jìn)蛋白水溶性表達(dá)效應(yīng)低于組氨酸標(biāo)

4、簽，而GroEL和MBP顯著提高了TEVp突變體活性。
　　5.分析提高胞內(nèi)稀有tRNA水平對(duì)標(biāo)簽效應(yīng)的影響。在RosettaTM(DE3)中， InfB(1–21)序列和MBP提高TEVp突變體水溶性效果最好。而InfB(1–21)序列和GroEL提高了蛋白酶活性效率最高。
　　6.分析融合蛋白中TEVp識(shí)別序列的作用。構(gòu)建了除去TEVp識(shí)別序列的MBP與TEVp的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)該序列對(duì)融合蛋白的可溶性表達(dá)沒(méi)有顯著影響，但

5、可以提高突變體在大腸桿菌RosettaTM(DE3)中的酶活性。
　　7.分別純化了帶不同標(biāo)簽突變體蛋白，分析了產(chǎn)量和活性，確定了不同親和介質(zhì)上酶切5個(gè)融合蛋白的效率。
　　綜上所述，本研究證明進(jìn)一步的氨基酸突變對(duì)改善蛋白酶水溶性受其它已突變位點(diǎn)的影響，一些融合蛋白標(biāo)簽對(duì)改善TEVp突變體的產(chǎn)量和質(zhì)量受內(nèi)源稀有tRNA豐度影響，在RosettaTM(DE3)中，我們首次證明GroES能提高TEVp蛋白突變體的水溶性；現(xiàn)有研究