稻瘟病菌絲氨酸蛋白酶基因MGSP3的功能分析.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)是研究絲狀真菌的重要模式生物，也是引起水稻重要病害稻瘟病的病原菌。植物與病原菌相互作用的過程中，涉及雙方許多信號分子的識別與傳導(dǎo)。在病原菌方面，這些信號分子往往就是與植物受體蛋白起作用的激發(fā)子和其它致病因子。分泌蛋白因其分泌到體外的特性，最有可能是病原菌分泌到細(xì)胞外與寄主受體蛋白起作用的激發(fā)子和致病因子。 數(shù)據(jù)庫與生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，稻瘟病菌基因組中有24個Subtilase家

2、族蛋白成員，預(yù)測他們都具有信號肽，以不同程度分泌到細(xì)胞外。通過比較其它病原菌Subtilase基因家族的結(jié)構(gòu)和功能，我們推測Subtilase基因家族在稻瘟病菌侵染致病過程中可能起著關(guān)鍵的作用。本論文選擇了具有代表性的一個Subtilase家族蛋白成員MGSP3(MGG_07965.5)，進(jìn)行了基因功能的研究。 首先將C-端加有His標(biāo)簽的MGSP3蛋白超表達(dá)于稻瘟病菌70-15菌株，分別應(yīng)用，TCA蛋白沉淀法、丙酮蛋白沉淀法、

3、Ni-NTA法在稻瘟病菌培養(yǎng)濾液中分離和純化目標(biāo)蛋白，證實(shí)了基因MGSP3表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到細(xì)胞外，是分泌蛋白。將純化的表達(dá)蛋白進(jìn)行了生物學(xué)活性的分析。 同時構(gòu)建了MGSP3基因敲除的轉(zhuǎn)化子，并對MGSP3超表達(dá)轉(zhuǎn)化子和敲除轉(zhuǎn)化子的表型進(jìn)行分析。超表達(dá)轉(zhuǎn)化子OEsp3-17-1生長速度相對于野生型的70-15明顯減慢，菌落顏色較白，產(chǎn)孢量增加；而敲除轉(zhuǎn)化子KOsp3-92-3對于野生型的Guy11在燕麥培養(yǎng)基則氣生菌絲明顯減少，

4、菌落顏色變黑，產(chǎn)孢量降低。用產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的菌絲塊造傷接種大麥品種金昌1316植株的葉片后，與野生型相比，敲除轉(zhuǎn)化子的病斑形成延遲、病斑變小。噴霧接種水稻C039實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KOsp3-92-3致病力輕微下降，0Esp3-17-1的致病力則顯著降低。但是同樣濃度孢子懸浮液離體接種大麥金昌1316后，兩個轉(zhuǎn)化子在大麥葉片上的發(fā)病情況與相應(yīng)的野生型的差異不明顯。 以上初步結(jié)果表明，MGSP3基因與稻瘟病菌的菌絲生長、產(chǎn)孢能力及侵染能