海洋芽孢桿菌S-12-86溶菌酶的發(fā)酵、純化與生物活性的研究.pdf

1、從海洋微生物代謝產(chǎn)物中可篩選出多種具有特殊功能的天然抗菌與抗病毒活性物質(zhì)。本課題組從東海海泥中篩選出一株產(chǎn)溶菌酶的菌株S-12-86。本論文對(duì)該菌所產(chǎn)溶菌酶的發(fā)酵條件、純化方法及其生物活性進(jìn)行研究，結(jié)果如下： 采用搖瓶發(fā)酵的方式，分別從培養(yǎng)基組分與發(fā)酵條件兩個(gè)方面對(duì)海洋芽孢桿菌S-12-86產(chǎn)酶的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明：菌株S-12-86能夠利用麥芽糖、淀粉、甘油和葡萄糖作為碳源，不能利用蔗糖與甘露醇；能夠利用牛肉膏、酵母膏、蛋

2、白胨和硫酸銨作為氮源，其中牛肉膏效果最佳，而硝酸鉀、氯化銨和尿素幾乎不被利用：Zn<'2+>、Mn<'2+>和Cu<'2+?>菌株S-12-86的生長和產(chǎn)酶均有抑制作用，F(xiàn)e<'2+>對(duì)菌體生長無明顯影響，但明顯抑制菌體產(chǎn)酶，Na<'+>和K<'+>對(duì)菌體的生長和產(chǎn)酶無明顯影響，Ca<'2+>對(duì)菌體生長有促進(jìn)作用，Mg<'2+>對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用。該菌種產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組分為葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0 g/L，MgSO

3、<,4> 5.0 g/L，CaCl<,2> 2.0 g/L。菌株S-12-86最適發(fā)酵條件：培養(yǎng)溫度為30℃、接種量為4.0％(v/v)、裝液量為10.0％(v/v)、產(chǎn)酶高峰在發(fā)酵24 h。經(jīng)測定，產(chǎn)酶量達(dá)25636.8U/mL，比優(yōu)化前14454.4U/mL提高了75.4％。中試發(fā)酵產(chǎn)酶量達(dá)26697.87 U/mL，說明搖瓶發(fā)酵優(yōu)化條件可以應(yīng)用于中試生產(chǎn)上。與白色鏈霉菌G、灰色鏈霉菌P-51、枯草芽孢桿菌77等產(chǎn)溶菌酶微生物的產(chǎn)酶

4、條件相比較，菌株S-12-86具有易培養(yǎng)、產(chǎn)酶量較高、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)。 將海洋芽孢桿菌S-12-86溶菌酶(marine.Bacillus S-12-86 lysozyme，MBL)的發(fā)酵液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀與透析脫鹽，Sephadex G-100凝膠柱層析，CM SepharoseFast Flow陽離子交換柱層析分步進(jìn)行純化。將純化得到的MBL以Tricine-SDS-PAGE進(jìn)行分析，分子量為16.0 kD。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)

5、果表明，MBL最適作甩pH值為8.0，最適作用溫度為35℃。Zn<'2+>和Cu<'2+>對(duì)MBL具有一定的激活作用，Mn<'2+>和Ag<'+>對(duì)MBL略有抑制作用，其它金屬離子如Ba<'2+>、Li<'+>、Ca<'2+>、Na<'+>、K<'+>和Fe<'3+>等對(duì)MBL活性沒有顯著影響；化學(xué)試劑與增稠劑對(duì)MBL活性幾乎沒有影響。陽離子烷基多苷(cationic Alkylpoly glycosides，cAPG)和烷基多苷(Al

6、kyl poly glycosides，APG)對(duì)MBL有激活作用，分別提高M(jìn)BL的活性為15％和21％；十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)對(duì)其有抑制作用，降低酶活性約為15％；Tween 20，Tween 80對(duì)MBL的影響不明顯。MBL在低溫下保存，酶活性較常溫保存損失??；MBL的凍干粉在常溫保存與低溫保存酶活損失相差不大，說明酶凍干粉比液體酶更適合于保存。 MBL的抑菌譜較為廣泛，對(duì)革蘭氏陽性菌

7、、革蘭氏陰性菌、真菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株均有抑制作用，主要抑制上述菌對(duì)數(shù)生長期初期的生長。電鏡觀察結(jié)果表明，經(jīng)MBL作用12 h后，大腸埃希氏菌有些菌體細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)不均勻，開始固縮，導(dǎo)致質(zhì)壁分離，部分細(xì)胞壁缺失，細(xì)胞膜破裂，菌體變形，有些細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)甚至解體出現(xiàn)空腔。金黃色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)不均勻，固縮較嚴(yán)重，中間有顏色較深成團(tuán)物質(zhì)出現(xiàn)，細(xì)胞壁變薄，有些細(xì)胞壁模糊不清，還存在質(zhì)壁分離現(xiàn)象。白色念珠球菌大部分菌的細(xì)胞壁出現(xiàn)嚴(yán)重變形，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)不均勻，細(xì)胞質(zhì)

8、中的空腔更多。酶對(duì)白色念珠球菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞作用隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng)。MBL發(fā)揮抑菌作用的濃度范圍在0.25 mg/mL～4.0mg/mL之間，發(fā)揮殺菌作用的濃度范圍一般在0.25 mg/mL～8.00mg/mL之間。 MBL含量在大于5.0 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠球菌有明顯的抑菌作用。0.5％～1.5％的APG無明顯抑菌作用。將MBL與APG復(fù)配后，APG能明顯地增強(qiáng)酶的抑菌作用。通過定量殺滅細(xì)菌

9、試驗(yàn)，測定5.0 mg/mLMBL+1.0mg/mL APG復(fù)配后(Compound Enzyme Prepration，簡稱CEP)的殺菌率；結(jié)果表明，CEP對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠球菌均有較強(qiáng)的殺菌能力。CEP在54℃培養(yǎng)箱中放置14 d后，其殺菌率保持不變，說明CEP的殺菌性能的穩(wěn)定性良好。 采用細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)(Cytopathogenic inhibition test)觀察MBL在PK15細(xì)胞中對(duì)偽狂犬病