大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞兩種方法比較的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞之外的另外一種干細(xì)胞，它不僅具有強(qiáng)大的增殖能力，在體外擴(kuò)增可獲得大量子代細(xì)胞，同時(shí)具有多向分化潛能，在一定條件下不僅可分化為中胚層起源的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，還可分化為外胚層起源的神經(jīng)細(xì)胞，更為重要的是，它具有胚胎干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞無法比擬的優(yōu)勢：自體MSCs易于獲得，可大量擴(kuò)增，自體移植無免疫排斥反應(yīng)，無倫理道德方面的限制，并且還可能避免了產(chǎn)生腫瘤的危險(xiǎn)。MSC

2、s有望成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想的種子細(xì)胞。為了尋找更為理想的誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的藥物及最佳誘導(dǎo)條件，本試驗(yàn)分別利用三磷酸腺苷(ATP)與神經(jīng)妥樂平(NT)作為誘導(dǎo)劑，進(jìn)行觀察比較，以期為臨床應(yīng)用MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.取一月齡SD大鼠，麻醉后無菌條件下，取雙側(cè)股骨和脛骨的骨髓，分離出MSCs，用貼壁法培養(yǎng)，并連續(xù)傳代、擴(kuò)增，以獲取更純化的MSCs，連續(xù)觀察細(xì)胞生長情況，以了解其生

3、長特性。 2.分別取第2、5、8代細(xì)胞，消化后以1×104/ml密度種于24孔板中，每隔24h按順序檢測3個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算3個(gè)孔細(xì)胞平均數(shù)，連續(xù)觀察10d，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，分別繪制生長曲線，并分別計(jì)算出MSCs在對數(shù)生長期的群體倍增時(shí)間(PDT)和整個(gè)增殖期平均的PDT以及增殖后所得到的MSCs的理論數(shù)值。 3.分別用ATP與NT為誘導(dǎo)劑對MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，比較不同濃度NT對MSCs的誘導(dǎo)作用

4、。 3.1NT的終濃度分為：0.5mu/ml、1mu/ml、1.75mu/ml、2.5mu/ml、5mu/ml，誘導(dǎo)后分別做巢蛋白(Nestine)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)算陽性細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選出最佳誘導(dǎo)濃度。 3.2ATP的終濃度采用劉文忠報(bào)道的50ug/ml進(jìn)行誘導(dǎo)。 3.3分別觀察ATP與NT在最佳誘導(dǎo)濃度時(shí)不同時(shí)間對MSCs的誘導(dǎo)作

5、用。誘導(dǎo)時(shí)間可分為：1d、3d、5d、7d、10d，誘導(dǎo)后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行檢測，計(jì)算出陽性細(xì)胞比例，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，找出兩藥各自的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。 3.4對ATP與NT各自于最佳條件下誘導(dǎo)出的陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較兩者對MSCs的誘導(dǎo)作用。 結(jié)論： 1.MSCs在體外培養(yǎng)條件下具有強(qiáng)大的增殖能力，且生長特性穩(wěn)定；MSCs在一定條件下可向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，更進(jìn)一步證明了其具有多向分化潛能。 2