脾虛證線粒體氧化損傷以及線粒體基因及其表達改變的研究.pdf

1、目的：脾為后天之本，氣血生化之源，在生命活動過程中占有重要地位。長期以來，脾虛證一直是人們研究的熱點。線粒體是糖、氨基酸、脂肪酸最終氧化的場所，并將這些成分在氧化與磷酸化中所釋放的能量儲存在ATP中，可以為細胞的各種生命活動提供能量，因此線粒體有細胞的“動力工廠”之稱。導師在1987年首先提出了“中醫(yī)脾一線粒體”相關的這一理論，隨著研究的深入，尤其近年來，中醫(yī)證候動物模型研究的廣泛開展，加之分子生物學的興起，為更深入探討“脾虛”的本質奠

2、定了理論基礎。關于脾虛與自由基的關系，己有不少研究證明，自由基損傷是脾虛證的病理基礎之一，氧自由基產生可影響線粒體的呼吸功能，繼而使mtDNA受到損傷。本研究以脾虛證模型大鼠組織中線粒體作為研究對象，運用健脾方藥治療脾虛模型大鼠，觀察脾虛大鼠線粒體氧化損傷情況，線粒體膜電位等，從自由基醫(yī)學角度來探討脾虛與線粒體的關系，以及健脾方藥的作用機制；以脾虛證患者外周血中線粒體作為研究對象，觀察線粒體DNA損傷情況，從基因與轉錄水平闡述脾虛患者線

3、粒體氧利用障礙的影響因素及發(fā)生機制，進一步探討脾虛證與線粒體相關性的分子生物學機制。 方法：研究包括文獻研究和實驗研究。文獻研究中，從古代中醫(yī)對脾及脾虛的認識、現(xiàn)代中醫(yī)對脾虛證的認識、線粒體與細胞的能量轉換的現(xiàn)代研究及脾與線粒體相關性的研究進展等方面進行了詳細的整理和總結。實驗研究由兩部分組成：第一部分選用SPF級SD大白鼠60只，隨機分為六組，即正常對照組、脾虛模型組、四君子湯組、當歸補血湯組、黃芪四君子湯組、當歸補血湯合四君

4、子湯組等，每組各10只。以破氣苦降加饑飽失常法制造大鼠脾虛模型，各組大鼠除正常對照組外每日灌飼小承氣湯煎劑60g/kg體重(20m1/kg體重)，隔日半量進食，自由飲水，造模15天結束。各藥物治療組均造模結束后給藥30天。實驗結束后觀察大鼠的一般情況，檢測大鼠肝、骨骼肌組織線粒體SOD、GSH-Px 活力、MDA 含量及肝、脾組織中膜電位水平。第二部分選擇脾虛證患者40例，濕熱蘊脾證患者10例，采用PCR直接測序法檢測其外周血白細胞線粒

5、體DNA ATP6 亞基基因序列突變情況，以及與8例正常人對照進一步檢測線粒體DNA ATP6 亞基基因mRNA表達情況。 結果： 1．脾虛模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的體重減輕，消瘦，糞便時軟、時溏，食量減少，游泳耐力下降，倦怠，懶動，蜷縮聚堆，瞇眼，弓背等典型脾虛癥狀，但肛溫無明顯變化，各藥物治療組能減輕造模對大鼠的影響。 2．脾虛模型組大鼠肝、骨骼肌組織中線粒體SOD、GSH-PX 活力較空白對照組明顯下降(P<0

6、.01)，各藥物治療組 SOD、GSH-PX 活力較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，升高的次序為：當歸補血湯合四君子湯組>黃芪四君子湯組>四君子湯組>當歸補血湯組。當歸補血湯合四君子湯組與黃芪四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，黃芪四君子湯組與四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，四君子湯組與當歸補血湯組之間差異顯著(P<0.05)。 3.脾虛模型組大鼠肝、骨骼肌組織中線粒體MDA含量較空白對照組顯著升高(P

7、<0.01)，各藥物治療組MDA含量較模型組明顯下降(P<0.05或P<0.01)，降低的次序為：當歸補血湯合四君子湯組>黃芪四君子湯組>四君子湯組>當歸補血湯組。當歸補血湯合四君子湯組與黃芪四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，黃芪四君子湯組與四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，四君子湯組與當歸補血湯組之間差異顯著(P<0.05)。 4.脾虛模型組大鼠肝臟及脾臟組織中線粒體膜電位較空白對照組明顯下降，差異顯著(P<0.0

8、1)，各藥物治療組均較模型組明顯升高(P<0.05或P<0.01)，升高的次序為：當歸補血湯合四君子湯組>黃芪四君子湯組>四君子湯組>當歸補血湯組。當歸補血湯合四君子湯組與黃芪四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，黃芪四君子湯組與四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，四君子湯組與當歸補血湯組之間差異顯著(P<0.05)。 5.經統(tǒng)計脾虛證患者組總突變率為95％，脾胃濕熱證組總突變率為100％。脾氣虛證組總突變率為80％，其中

9、同義突變率為33％，缺失率為20％，插入突變率為13％：氣虛不攝血證組總突變率為100％，其中同義突變率為58％，缺失率為0，插入突變率為17％：脾陰虛證組總突變率為100％，其中同義突變率為0，缺失率為25％，插入突變率為25％；脾陽虛證組總突變率為100％，其中同義突變率為11％，缺失率為0，插入突變率為O；脾胃濕熱證組總突變率為100％，其中同義突變率為40％，缺失率為0，插入突變率為0。 ①脾氣虛證組 8550T、859

10、9C 插入突變各1例，引起mRNA 閱讀框架改變，發(fā)生率均為6.7％；A8555T、C8563T、C8575G、A8566G、A8567G點突變各1例，分別使編碼氨基酸由組氨酸變?yōu)榱涟彼?、組氨酸變?yōu)轳槹彼?、脯氨酸變?yōu)楸彼?、異亮氨酸變?yōu)榻Y氨酸、天酰氨酸變?yōu)榻z氨酸，發(fā)生率均為6.7％；A8564、A8566、C8560空缺失突變各1例，引起mRNA 閱讀框架改變，發(fā)生率均為6.7％。 ②氣不攝血證組8570T插入突變2例，引起mR

11、NA 閱讀框架改變，發(fā)生率17％；A8567G 點突變2例、C8552G 點突變1例，分別使編碼氨基酸由天酰氨酸變?yōu)榻z氨酸、丙氨酸變?yōu)楦拾彼幔l(fā)生率分別為17％、8.3％。 ③脾陰虛證組共4例患者，分別為8608C插入突變1例，C8599空缺失突變1例，均引起mRNA閱讀框架改變；C8649A點突變1例，T8602c 點突變1例，使編碼氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦彼帷?④脾陽虛證組C9196T、C9199T點突變各4例，均使編

12、碼氨基酸由谷酰氨酸變?yōu)榻K止密碼子，發(fā)生率均為44％。 ⑤脾胃濕熱證組C9197T點突變3例、C9200T 點突變1例，均使編碼氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，發(fā)生率分別為30％、10％；G8885A點突變2例，均使編碼氨基酸由精氨酸變?yōu)橘嚢彼?，發(fā)生率為20％。 6.正常人組的熒光生長曲線呈明顯陽性；脾虛證各組和脾胃濕熱證組熒光反應均弱于正常人組，差異顯著(P<0.01)；脾氣虛證組的熒光反應弱于脾陰虛證組(因病例數(shù)偏少，未進行統(tǒng)計學

13、比較)和脾陽虛證組(P<0.01)；脾氣虛證組熒光反應雖弱于脾胃濕熱證組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；脾陽虛證組熒光反應弱于脾胃濕熱證組，差異顯著(P<0.01)。 結論： 1.饑飽失常加苦降破氣法，是目前塑造脾虛動物模型較理想的方法之一。 2.脾虛模型大鼠組織線粒體中存在氧化抗氧化失衡，提示脾虛證和線粒體氧化損傷發(fā)生密切相關。 3.脾虛證大鼠組織的線粒體膜電位比配的降低說明脾虛證模型存在線粒體功能的

14、損傷，脾虛證與線粒體膜電位密切相關。 4.氣血雙補法對于升高脾虛證大鼠組織中SOD，GSH-Px 活性，降低MDA含量，以及提高線粒體膜電位水平效果優(yōu)于單純補氣健脾法，說明補氣健脾方中加入補血養(yǎng)血，活血行血之劑后，能夠明顯增強補氣的作用。 5.脾虛證患者存在mtDNA 堿基點突變、缺失或插入，并造成編碼氨基酸組成以及閱讀框架的改變，導致mtDNA損傷，進而基因表達的下降，使得生成功能異?；驘o功能的亞基蛋白而直接影響F<,