中醫(yī)脾虛證與線粒體能量代謝的分子生物學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)研究分析脾氣虛證和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌、心肌線粒體能量代謝，探討中醫(yī)脾虛證候與線粒體功能的關(guān)系；并闡明脾氣虛證與脾不統(tǒng)血證大鼠兩種證候的實(shí)質(zhì)及其線粒體能量代謝差異的機(jī)理。
　　方法：
　　1.脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠模型的構(gòu)建
　　將SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為四組，正常對(duì)照組，低分子肝素鈉對(duì)照組，脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組。采用游泳疲勞加飲食失節(jié)法處理脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠，構(gòu)建脾氣虛證大鼠模型

2、。成功后，在維持上述處理因素的基礎(chǔ)上，對(duì)脾不統(tǒng)血組大鼠皮下注射低分子肝素鈉處理，構(gòu)建脾不統(tǒng)血證大鼠模型。記錄大鼠體征和行為變化，并檢測(cè)其生理代謝變化。
　　2.測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠組織ATP含量，分析脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌、心肌能量代謝情況。
　　3.檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物（ComplexⅠ、ComplexⅡ、ComplexⅢ、ComplexⅣ）的活性。
　　4.檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織

3、線粒體檸檬酸合酶（CS）的活性。
　　5.測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠線粒體DNA拷貝數(shù)，分析脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌、心肌線粒體變化。
　　6.提取實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)COXIV蛋白和Cyt-C蛋白表達(dá)量的變化。
　　7.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織中COXIV蛋白和Cyt-C蛋白的mRNA表達(dá)量變化。
　　結(jié)果：

4、　　1.造模處理42天后，成功構(gòu)建脾氣虛證大鼠模型，75天后，成功構(gòu)建脾不統(tǒng)血證大鼠模型，為研究脾虛證和線粒體的關(guān)系立下基礎(chǔ)。
　　2.脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌ATP含量較正常大鼠均顯著性降低，并且二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。末期脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌 ATP含量較正常大鼠均顯著性降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性較正常大鼠均顯著降低，且二者之

5、間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。末期脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性較正常大鼠均顯著降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌檸檬酸合酶活性較正常大鼠均顯著性降低，且二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌檸檬酸合酶活性較正常大鼠均顯著性降低，且二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)較正常大鼠均顯著性降低，

6、但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在心肌中，脾不統(tǒng)血證大鼠mtDNA拷貝數(shù)較正常大鼠顯著性升高，脾氣虛組大鼠 mtDNA雖略顯升高，但與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與脾不統(tǒng)血組大鼠相比也沒(méi)有顯著性差異。
　　6.脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌 COXIV蛋白表達(dá)量較正常大鼠均顯著降低，Cyt-C蛋白表達(dá)量均顯著升高，但兩組大鼠骨骼肌的這兩種蛋白表達(dá)量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。末期脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌COXIV蛋白表達(dá)量較正常大鼠均

7、顯著性降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；脾氣虛組中期大鼠的心肌Cyt-C蛋白表達(dá)量較正常大鼠顯著性降低，脾不統(tǒng)血組末期大鼠的心肌Cyt-C蛋白表達(dá)量則顯著升高。
　　7.脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌COXIV蛋白的mRNA表達(dá)量較正常大鼠均顯著性降低，Cyt-C蛋白的mRNA表達(dá)量均顯著性升高，但兩組大鼠這兩種蛋白的mRNA表達(dá)量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌 COXIV蛋白的mRNA表達(dá)量較正常大鼠顯

8、著性降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；脾氣虛組中期大鼠心肌Cyt-C蛋白的mRNA表達(dá)量較正常大鼠顯著性降低，脾不統(tǒng)血組末期大鼠心肌Cyt-C蛋白的mRNA表達(dá)量則顯著性升高。
　　結(jié)論：
　　1.中醫(yī)脾虛病證與線粒體能量代謝障礙互為因果關(guān)系。
　　2.脾虛證大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性及檸檬酸合酶活性的降低，是其組織ATP含量降低的重要原因。
　　3.脾虛證線粒體能量代謝障礙涉及線粒體DNA拷貝數(shù)的變化與COXIV