魚皮降血壓肽的制備及其降血壓活性研究.pdf

1、高血壓是當(dāng)今困擾全球的一種心血管疾病,同時(shí)也是誘發(fā)冠心病心腎功能衰竭的最主要因素。它常伴有心臟,血管,腦和腎等器官器質(zhì)性病變,是引發(fā)心,腦,腎和眼等多種并發(fā)癥和導(dǎo)致中風(fēng),冠心病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因子。全世界每年因高血壓而死亡的人數(shù)達(dá)1200萬(wàn),在我國(guó),高血壓的發(fā)病率隨著經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)也逐年增高,目前,我國(guó)有高血壓患者近1億,每年死于心血管病的人數(shù)達(dá)200萬(wàn),已高居死亡原因的首位,高血壓為其主要的危險(xiǎn)因素。調(diào)查顯示,在高血壓患者中,發(fā)現(xiàn)血壓升高的

2、占25%,接受治療的只占12%,而能有效控制血壓的僅有3%,日本早在20世紀(jì)90年代就對(duì)降血壓肽進(jìn)行了深入的研究,我國(guó)高血壓的防治任重而道遠(yuǎn)。來(lái)源于食物蛋白的降血壓肽以其無(wú)毒副作用、安全性高且對(duì)血壓正常者無(wú)降壓作用,適合長(zhǎng)期服用等特點(diǎn)受到了各個(gè)國(guó)家的關(guān)注。食用蛋白研制的降血壓肽應(yīng)用前景巨大,越來(lái)越成為降血壓研究的一大亮點(diǎn),目前,人們相繼從發(fā)酵乳、葵花籽粕、杏仁蛋白、米糠蛋白等制備出了降血壓肽,但是利用巴沙魚皮生產(chǎn)降血壓肽的報(bào)道卻鮮有出現(xiàn)

3、。
　　 巴沙魚在分類上屬鲇形目(Siluriformes)芒科(Pangasiidae)芒鯰屬(Pangasiushaniltoa)芒鲇(Haniltoa),是湄公河流域特有的名貴高檔經(jīng)濟(jì)魚類。該魚在生長(zhǎng)過(guò)程中,腹腔內(nèi)積累有三塊較大的油脂,約占體重的58%。該魚具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、產(chǎn)量高、食性廣、易飼養(yǎng)、肉質(zhì)白嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、無(wú)肌間小刺、利于加工等優(yōu)點(diǎn)。目前已在我國(guó)湖北省英山縣繁育成功,對(duì)巴沙魚的利用和加工主要集中在魚

4、肉方面,魚皮、魚骨等具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的產(chǎn)品大都被直接丟棄或作為動(dòng)物飼料。巴沙魚皮中Pro含量較高,巴沙魚皮膠原蛋白含量為74.83%,研究表明pro含量高的原料可能更有利于制備高活性降血壓肽。
　　 本文以巴沙魚皮為原料,再通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn);以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensinconveningenzyme,ACE)抑制率為指標(biāo),從四種商業(yè)蛋白酶中篩選出復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解,制備高活性的降血壓肽,

5、選用超濾、葡聚糖凝膠層析色譜法、高效液相
　　 色譜法對(duì)酶解后的多肽進(jìn)行純化分離;最后將純化后的多肽進(jìn)行分析,為下一步人工合成降血壓肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　 (1)蛋白酶選擇實(shí)驗(yàn)
　　 本試驗(yàn)選擇堿性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶對(duì)脫脂后的巴沙魚皮膠原蛋白進(jìn)行酶解,以ACE抑制率作為指標(biāo),選出復(fù)合蛋白酶作為試驗(yàn)用酶。
　　 (2)巴沙魚皮膠原蛋白酶解技術(shù)參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)
　　

6、選酶結(jié)束后,分別進(jìn)行了固液比、酶解時(shí)間、酶底比等單因素試驗(yàn),在酶解單因素實(shí)驗(yàn)中,酶解時(shí)間選擇1h,固液比選擇1:7-1:9,酶底比選擇200u/g,在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn),最后得出其最佳的酶解技術(shù)參數(shù):酶底比:340μ/g、酶解時(shí)間:1.27h、固液比:1:7.7,在此條件酶解液的IC50=1.417mg/mL。
　　 (3)超濾分離純化巴沙魚皮降血壓肽
　　 酶解液用20目濾膜過(guò)濾后,稀釋五倍,

7、所得濾液采用分子量為30KD的超濾膜進(jìn)行初步分離,除去未水解的蛋白質(zhì)、不溶底物、及多糖等大分子雜質(zhì)。超濾氣壓(N2為載氣)控制在0.2MPa左右,多次收集流出液,超濾膜上部大分子液體,將流出液和超濾膜上部大分子液體分別收集,冷凍干燥,測(cè)定分子量大于30KD,分子量小于30KD和酶解原液的IC50值,試驗(yàn)結(jié)果表明,分子量小于30KD的多肽降血壓活性最高。
　　 (4)巴沙魚皮降血壓肽的葡聚糖凝膠和反式RP-HPLC純化
　　

8、 選用SephadexG-50葡聚糖凝膠層析對(duì)分子量小于30KD的多肽進(jìn)行進(jìn)一步純化,得到2個(gè)吸收峰,分別對(duì)2各峰進(jìn)行抑制率活性的測(cè)定,組分Ⅰ和組分Ⅱ的IC50分別為1.362mg/mL和0.699mg/mL,選擇組分Ⅱ的多肽進(jìn)行反式RP-HPLC純化。
　　 (5)巴沙魚皮降血壓肽的理化性質(zhì)分析
　　 巴沙魚皮降血壓肽在pH2-10范圍內(nèi)的溶解度變化幅度較小,顯示較高的溶解度,溶解度均大于80%。降血壓肽具有較強(qiáng)的吸