NLRC4炎癥小體激活的分子機(jī)制研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞是宿主先天性免疫反應(yīng)的重要組成部分。在細(xì)菌感染發(fā)生時(shí)，這些細(xì)胞通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子以及發(fā)生一種以Caspasel激活為特征的被稱為“pyroptosis”的細(xì)胞死亡來(lái)抑制細(xì)菌的繁殖散布，幫助細(xì)菌的清除。目前已知這些細(xì)胞通過(guò)識(shí)別細(xì)菌來(lái)源的一些保守分子而被激活，這些保守分子包括細(xì)菌的鞭毛蛋白和三型分泌系統(tǒng)的基座蛋白。通過(guò)遺傳學(xué)的方法構(gòu)建基因敲除的小鼠，人們發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞中的Nlrc4基因在這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著

2、重要作用。NLRC4屬于近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的Nod-LikeReceptors(NLRs)家族，結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示該蛋白具有N端CARD結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)合核酸的結(jié)構(gòu)域以及C端富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域LRRs(LeucineRichRepeats)。LRRs存在于表達(dá)在細(xì)胞表面的Toll-LikeReceptor(TLRs)中，這一結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合配體包括來(lái)源于細(xì)菌的內(nèi)毒素、核酸以及鞭毛蛋白并且激活下游NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路。這一結(jié)構(gòu)域的存在使得人們猜測(cè)

3、NLRC4蛋白也是通過(guò)作為基座蛋白、鞭毛蛋白的受體發(fā)揮作用的，但是目前還沒(méi)有證據(jù)支持這一假設(shè)。我們?cè)噲D研究NLRC4分子參與宿主細(xì)胞識(shí)別鞭毛蛋白以及基座蛋白的機(jī)制。利用炭疽病原菌分泌的致死毒素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的機(jī)制，我們建立了把鞭毛蛋白等刺激物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的新方法以代替細(xì)菌感染的體系。這樣的體系更利于生化機(jī)制的研究，利用在巨噬細(xì)胞基因敲低的方法，我們發(fā)現(xiàn)了Naip2、Naip5基因的敲低可以分別抑制三型分泌系統(tǒng)基座蛋白和鞭毛蛋白激活巨噬細(xì)胞

4、Caspasel，表明這兩個(gè)基因分別參與了基座蛋白和鞭毛蛋白引起的NLRC4信號(hào)通路的激活。通過(guò)酵母雙雜交和免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法，我們發(fā)現(xiàn)NAIP2、NAIP5蛋白可以特異性的結(jié)合基座蛋白和鞭毛蛋白。NAIP2、NAIP5結(jié)合相應(yīng)的配體后會(huì)招募NLRC4形成蛋白復(fù)合物并且激活Caspasel，激活形式的Caspasel切割前體形式的IL-1β、IL-18為成熟形式并促進(jìn)這些細(xì)胞因子的分泌。這一信號(hào)通路可以在外源轉(zhuǎn)染NAIP、NLRC4、

5、Caspasel、pro-IL-1β四個(gè)蛋白表達(dá)基因的非免疫細(xì)胞得到功能性的重組，有力的證明了NAIP蛋白的功能。我們的研究結(jié)果揭示了宿主細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌來(lái)源異源物質(zhì)的機(jī)制，首次證明了NLRs家族中的NAIP2、NAIP5蛋白分別作為基座蛋白和鞭毛蛋白的直接受體行駛功能，而NLRC4蛋白只是起到傳遞信號(hào)至下游分子的作用。
　　 Naip基因在小鼠中有7個(gè)直系同源基因，在人類卻只有一個(gè)對(duì)應(yīng)的基因。我們的研究揭示了小鼠中其中兩個(gè)成員的功

6、能是作為胞內(nèi)受體識(shí)別細(xì)菌來(lái)源的異源保守分子，這也提示了其它NAIP蛋白成員可能識(shí)別目前尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌來(lái)源刺激物。通過(guò)細(xì)菌遺傳學(xué)的研究，我們發(fā)現(xiàn)組成病原菌三型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)蛋白中除了基座蛋白，組成其針狀孔道的單體蛋白Neddleprotein也能在鼠源巨噬細(xì)胞上激活Caspasel，并且這種激活依賴于Nlrc4基因的表達(dá)。同樣通過(guò)小RNA介導(dǎo)的基因敲低方法，我們發(fā)現(xiàn)了NAIP1蛋白在Neddleprotein識(shí)別中發(fā)揮作用。