養(yǎng)殖刺參（Apostichopus japonicus）腐皮綜合癥主要致病菌快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、繼藻、蝦、貝、魚四次養(yǎng)殖浪潮之后，海參養(yǎng)殖成為我國北方海水養(yǎng)殖的新熱點。2006年，山東、遼寧兩省鮮海參總產(chǎn)量逾10萬噸，總產(chǎn)值超100億元。從海參的育苗、養(yǎng)殖，到海參產(chǎn)品的精深加工都掀起了一股巨大的投資熱潮。然而養(yǎng)殖的過速發(fā)展和不規(guī)范運作造成了養(yǎng)殖刺參疾病大規(guī)模爆發(fā)。2002年起，山東遼寧兩省養(yǎng)殖刺參不斷發(fā)生疾病，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。其中以“腐皮綜合癥”危害最為嚴(yán)重，造成刺參較高的死亡率。疾病快速診

2、斷技術(shù)對于疾病防治具有重要意義，本文首次針對養(yǎng)殖刺參“腐皮綜合癥”主要致病菌燦爛弧菌、假交替單胞菌進(jìn)行快速檢測技術(shù)的研究。 以本實驗室鑒定的刺參“腐皮綜合癥”兩種主要致病菌燦爛弧菌(Vibrio splendidus，H1)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens，H2)為抗原，用不同混合比例的兩種抗原免疫大白鼠，通過凝集反應(yīng)與間接ELISA方法檢測多克隆血清抗體的效價，結(jié)果表明H1與H2混合

3、比例1：1與2：3制備的抗體效價變化并不明顯，提示在制備二聯(lián)兔多克隆抗體時，以這兩種混合比例制備抗體較好。以燦爛弧菌H1、假交替單胞菌H2和混合抗原H1、H2制備兔抗血清KHl、KH2、二聯(lián)多克隆抗體KH12，凝集反應(yīng)測得三種抗血清效價均在1280以上，交叉反應(yīng)較弱，能夠應(yīng)用于免疫快速檢測。 以凹玻片為反應(yīng)載體，建立了玻片直接凝集反應(yīng)檢測方法。反應(yīng)體系中抗原25μL，抗體25μL；固定抗原反應(yīng)濃度6×10<'8>cells/mL

4、，抗體稀釋度以KHl 320，KH2 160，KHl2 160為最佳，在此稀釋度下基本不發(fā)生交叉反應(yīng)；20℃和37℃的反應(yīng)溫度對凝集反應(yīng)速度影響并不顯著，其反應(yīng)靈敏度1.5×10<'8>cells/mL。應(yīng)用該方法對人工感染試驗系統(tǒng)中水體、患病海參組織等培養(yǎng)出的優(yōu)勢菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法可以檢出各感染組相應(yīng)病原菌。 在建立辣根過氧化酶標(biāo)記細(xì)菌抗原的方法的基礎(chǔ)上研究了雙抗原夾心ELISA檢測方法。反應(yīng)條件為：最佳包被抗原濃度1

5、0<'7>cells/mL；標(biāo)記HRP-抗原稀釋度100；抗血清工作濃度KH1 320、KH2 160、KH12 160。吸收試驗與阻斷試驗結(jié)果均呈陰性；檢測靈敏度1.87×10<'4>cells/mL。對人工感染試驗水體及患病海參組織培養(yǎng)菌進(jìn)行了雙抗原ELISA檢測，凝集反應(yīng)檢測結(jié)果陽性的，雙抗原ELISA檢測結(jié)果也呈陽性。二聯(lián)抗體可以同時對兩種致病菌進(jìn)行檢測。建立了兩種病原菌的Dot-ELISA檢測方法。根據(jù)方正試驗，確定檢測用一抗

6、、二抗最佳工作稀釋度：燦爛弧菌抗血清稀釋度320，酶標(biāo)二抗稀釋度3000；假交替單胞菌抗血清稀釋度160，酶標(biāo)二抗稀釋度2000。阻斷試驗結(jié)果表明兩種抗血清特異性均較高。燦爛弧菌抗血清在稀釋度40與溶藻膠弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌等弧菌發(fā)生微弱交叉反應(yīng)，提高稀釋度到160時，不發(fā)生交叉反應(yīng)。假交替單胞菌抗血清基本不與常見海水致病弧菌發(fā)生交叉反應(yīng)。人工感染試驗檢測結(jié)果表明該方法能從患病海參潰爛組織、未發(fā)病海參組織和感染水體檢測到相應(yīng)致病菌，

7、檢測靈敏度為9.4×10<'3>+/mL。人工感染試驗檢測結(jié)果經(jīng)直接凝集反應(yīng)驗證。該方法操作簡便、靈敏度高，不需復(fù)雜儀器設(shè)備，適合在基層推廣。 以載玻片為介質(zhì)，建立了刺參“腐皮綜合癥”兩種病原菌的間接熒光抗體檢測技術(shù)。建立了熒光顯微鏡10個視野菌落數(shù)(400×)與已知濃度菌的關(guān)系曲線。通過關(guān)系曲線，未知養(yǎng)殖水體中特定病原菌檢測時，根據(jù)熒光顯微鏡視野中菌數(shù)可以初步判斷水體中致病菌數(shù)量。檢測交叉反應(yīng)菌，阻斷試驗，吸收試驗結(jié)果表明本方

8、法具有較高的特異性。通過二聯(lián)抗體和抗血清分別對人工感染刺參進(jìn)行檢測，可以檢出水體和潰爛部位相應(yīng)病原菌，病原菌被染成特異性黃綠色，可檢測到水體中2.4×10<'4> cells/mL的菌量。但是經(jīng)過樣品濃縮處理，可以檢測到低至8×10<'2>cells/mL的病原菌。冰凍切片檢測結(jié)果顯示刺參嘴部腫脹與皮膚潰爛肌肉中含有大量致病菌。試驗表明采用IFAT可以對刺參“腐皮綜合癥”兩致病菌進(jìn)行準(zhǔn)確快速的檢測，還可以用于養(yǎng)殖水體特定病原菌的數(shù)量監(jiān)測

9、。 在建立玻片直接凝集方法、雙抗原夾心ELISA法、Dot-ELISA、間接熒光抗體技術(shù)等快速檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，對人工感染試驗的感染水體、患病刺參潰爛肌肉、未患病海參肌肉以及空白對照組等樣品不經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)，通過樣品處理濃縮，直接用進(jìn)行快速檢測。結(jié)果顯示：采取樣品濃縮方式進(jìn)行快速檢測，陽性檢出率比細(xì)菌培養(yǎng)檢出率低。玻片凝集、雙抗原ELISA、Dot-ELISA、間接熒光抗體檢測人工感染試驗陽性檢出率分別是10％、72％、88.9％