奉節(jié)臍橙果皮褐變生理及相關(guān)基因的分離研究.pdf

1、奉節(jié)臍橙(CitrussinensisOsbeck)是一種優(yōu)良的甜橙鮮食品種，在國內(nèi)外市場享有較高聲譽，是重慶市柑橘出口中唯一具有較強競爭優(yōu)勢的品種。但奉節(jié)臍橙果皮褐變發(fā)生較嚴(yán)重，主要癥狀為油胞破裂下陷、形成褐斑，極大地影響了果實的外觀質(zhì)量和商品價值。目前對臍橙果皮褐變的發(fā)生機制尚未進(jìn)行深入研究，缺乏相應(yīng)的控制措施，這已成為目前臍橙商品生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵制約因素。因此迫切需要開展果皮褐變的生理及分子機制研究。 本研究以‘奉園72-1

2、’臍橙為材料，果實采后分別采用常溫(15℃)貯藏(對照)、低溫(5℃)貯藏、打蠟或機械損傷后常溫保藏，貯藏10周，每周測定一次生理指標(biāo)。果皮褐變率統(tǒng)計結(jié)果顯示，打蠟和機械損傷能加速果皮褐變的發(fā)生，5℃低溫貯藏可以減少果皮褐變。對過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性研究發(fā)現(xiàn)，果皮褐變最嚴(yán)重的損傷果POD和PPO活性較高；打蠟促進(jìn)PPO活性上升，而低溫能有效抑制PPO活性。對苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性研究發(fā)現(xiàn)，PAL活性與果皮褐

3、變率之間高度相關(guān)，損傷處理PAL活性最高。通過半定量RT-PCR方法研究pal基因在機械損傷和果皮褐變過程中的作用，發(fā)現(xiàn)損傷能增強pal2基因表達(dá)，且褐變果中pal2的表達(dá)明顯強于未褐變果；pal6基因的表達(dá)模式與pal2相似，即在損傷果和褐變果中均表達(dá)增加，但pal6基因的表達(dá)水平明顯低于pal2。因此我們認(rèn)為PAL活性及pal基因表達(dá)與臍橙果皮褐變之間具有密切關(guān)系，在果實受到損傷和果皮褐變過程中，pal2基因?qū)AL酶活性的影響強于

4、pal6基因。 在第二次生理落果結(jié)束后進(jìn)行葉面噴鈣結(jié)合單果套袋處理可顯著降低果實采后果皮褐變的發(fā)生，提高果實外觀質(zhì)量和商品性。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：田間噴鈣、套袋處理后適期采收，在采后處理及貯運中盡量減少機械損傷，采用適宜低溫冷藏可有效減輕臍橙果皮褐變的發(fā)生。 為了探明臍橙果皮褐變的分子機制，分別以褐變與未褐變的果皮mRNA作為檢測方和驅(qū)動方，利用抑制差減雜交(SSH)技術(shù)，構(gòu)建了臍橙果皮褐變正向差減cDNA文庫。SSH

5、文庫中陽性克隆92個，陽性克隆比例為70﹪，重組子插入片段大小主要分布在150bp-600bp之間。隨機挑取部分陽性克隆測序，測序結(jié)果利用NCBI的BLASTn和BLASTx在線軟件進(jìn)行序列相似性分析。在50個已經(jīng)測序的克隆中單一克隆為28個，其中有22個在GenBank中具有同源序列，占單一克隆數(shù)的78.6﹪，另有6個未找到同源序列，可能代表了新基因。同源基因中包含了與物質(zhì)代謝、成熟衰老以及脅迫病害相關(guān)的蛋白質(zhì)，說明柑橘果皮褐變的發(fā)生

6、是一個涉及到衰老、脅迫反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面的復(fù)雜的生理生化過程。以柑橘管家基因ubiquitin為內(nèi)對照，通過半定量RT-PCR方法鑒定差減文庫中分離的鈣結(jié)合蛋白基因、半胱氨酸蛋白酶基因、NAC-域蛋白基因、脅迫與病害相關(guān)蛋白基因和膨脹素基因是否為果皮褐變差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示它們均在褐變果皮中有上調(diào)表達(dá)，說明這些基因表達(dá)的增強可能與果皮褐變密切相關(guān)。 為了進(jìn)一步獲得果皮褐變相關(guān)基因的信息，采用RACE技術(shù)克隆了3個果皮褐變差

7、異基因的全長cDNA序列：(1)臍橙膨脹素基因CsEXP(GenBank登錄號DQ665898)，全長1077bp，編碼252個氨基酸，分子量為26.86kDa，等電點為7.93。同源性分析顯示CsEXP與膨脹素(Expansin)具有很高的同源性，具有α-Expansin蛋白的保守序列，即C-端的try殘基，序列中央的HFDmotif以及N-端的cys殘基；生物信息學(xué)分析表明其N-端具有一信號肽序列，跨膜預(yù)測結(jié)果表明該蛋白的N端4-2

8、3aa處有一跨膜結(jié)構(gòu)。(2)臍橙脅迫與病害相關(guān)蛋白基因CsSPR(登錄號EF010853)，全長679bp，編碼161個氨基酸，分子量為17.60KDa，等電點為5.74。沒有信號肽序列和跨膜區(qū)。具有病害相關(guān)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域BetⅥ。(3)臍橙鈣結(jié)合蛋白基因CsCAB(登錄號EF010854)，全長984bp，編碼207個氨基酸，分子量為22.95KDa，等電點為4.5，沒有信號肽序列和跨膜區(qū)，具有鈣結(jié)合蛋白的保守的兩個EF-hand結(jié)

9、構(gòu)域。 以CsEXP、CsSPR、CsCAB基因的3'-非同源區(qū)標(biāo)記同位素32P為探針，分別與褐變、非褐變果皮RNA進(jìn)行Northern雜交；另外，以CsEXP3'-非同源區(qū)為探針，與4℃、40℃、傷害、0﹪O2、3﹪O2和乙烯處理后6h，12h，24h的果皮RNA進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果顯示，CsEXP、CsSPR、CsCAB在褐變果皮中的表達(dá)均明顯高于對照，進(jìn)一步證實它們屬于果皮褐變相關(guān)基因；CsEXP在脅迫初期的表達(dá)

10、分析顯示，高溫(40℃)抑制CsEXP的表達(dá)，3﹪O2對其表達(dá)無影響，而在傷害、低溫(4℃)、無氧和乙烯處理后24h內(nèi)，CsEXP的表達(dá)都上升，表明這些處理誘導(dǎo)了CsEXP基因表達(dá)，可能CsEXP在對脅迫刺激的反應(yīng)中起作用；由于低氧、傷害等脅迫條件都可能誘導(dǎo)果皮褐變的發(fā)生，因此CsEXP在對脅迫反應(yīng)中的上調(diào)表達(dá)很可能是果皮褐變發(fā)生的早期信號。 本研究首次通過抑制差減雜交法進(jìn)行臍橙果實轉(zhuǎn)錄譜差異分析，建立臍橙果皮褐變差減文庫；篩選