血小板活化與兔VX2移植瘤相關(guān)性的研究.pdf

1、目的:對兔VX2肝移植瘤不同時期外周血中血小板活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測、比較,觀察血小板活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)水平的變化以及血小板活化與血栓形成、肝癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系,探討腫瘤細(xì)胞與血栓形成、血小板活化之間的相關(guān)性,及血小板活化在肝癌病程進(jìn)展、血行轉(zhuǎn)移中的重要作用,為臨床肝癌的診斷、治療、病情評估及預(yù)后等方面提供更多的理論依據(jù),從血液學(xué)角度尋求抗癌治療新靶點,進(jìn)一步提高肝癌患者的臨床診治水平,延長肝癌患者

2、的壽命,提高肝癌患者的生活質(zhì)量。
　　 方法:1.將健康新西蘭大白兔共90只,隨機(jī)分為:①肝移植瘤模型組30只；②假手術(shù)組30只；③正常對照組30只；2.兔VX2肝移植瘤瘤株的復(fù)蘇:從負(fù)氮瓶中取出兔VX2瘤株(瘤株由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院動物實驗中心提供),置于恒溫箱中水浴復(fù)蘇,復(fù)蘇溫度約為25—28℃,5分鐘后取出復(fù)蘇的瘤株,置于無菌玻璃器皿中,加入3ml含2萬u慶大霉素的生理鹽水,在無菌箱中將瘤株剪成1-2mm3大小的碎塊,混

3、勻制成混懸液備用；3、荷瘤兔的制備:選健康新西蘭大白兔2只,固定于動物臺上,選右側(cè)臀部作為注射點,脫毛、常規(guī)消毒注射點皮膚后,用18G針頭注入1ml備用的瘤細(xì)胞混懸液,拔針后壓迫5分鐘,防止瘤細(xì)胞混懸液從穿刺道溢出,保證瘤株種植成功。荷瘤兔種植1周后,觀察荷瘤兔存活,觸摸其右側(cè)臀部已長出直徑約2cm大小的包塊,荷瘤兔制備成功;4、瘤細(xì)胞混懸液的制備:準(zhǔn)備切開荷瘤兔臀部腫瘤組織,制備瘤細(xì)胞混懸液,進(jìn)行傳代轉(zhuǎn)種。用速眠星Ⅱ號將荷瘤兔全麻,無

4、菌條件下剝離腫瘤,切開瘤體,取靠近包膜的灰白色魚肉樣組織置于生理鹽水(含慶大霉素2萬U)中,剔除壞死組織及纖維組織,將瘤組織剪碎成1-2mm3小塊,加入生理鹽水適量制成濃度約為5×1010個／L的混懸液備用。5、兔VX2肝移植瘤模型建立選健康新西蘭大白兔30只由背部脊柱旁皮下注射速眠星Ⅱ號1ml,觀察實驗動物麻醉成功。將其仰臥位固定于動物臺上,取上腹部劍突下正中線處為切口選擇處,局部脫毛、常規(guī)消毒后切開皮膚,切口長約3cm左右,逐層分離

5、皮下組織,打開腹腔,暴露肝臟。輕柔將肝臟拉出,用18G針頭在肝臟左葉注入瘤細(xì)胞混懸液1ml,進(jìn)針深度約2cm左右。拔針后用明膠海綿填塞、壓迫穿刺道5分鐘,回納肝臟,逐層關(guān)腹。依次成功種植兔VX2肝移植瘤模型30只；6、假手術(shù)組的建立選健康新西蘭大白兔30用上述同樣方法麻醉后,仰臥位固定于動物臺上,取上腹部劍突下正中線處為切口處,局部脫毛、常規(guī)消毒后切開皮膚,切口長約3cm左右,逐層分離皮下組織,打開腹腔,暴露肝臟。輕柔將肝臟拉出,在肝臟

6、左葉用18G針頭注入生理鹽水1ml,進(jìn)針深度約2cm左右。拔針后用明膠海綿填塞、壓迫穿刺道5分鐘,回納肝臟,逐層關(guān)腹,依次成功操作假手組兔子30只；7、正常對照組30只健康新西蘭大白兔未進(jìn)行任何干預(yù)作為對照；8、采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別于瘤株種植前、瘤株種植后6h、48h、1w、2w采各組實驗動物外周血,檢測血小板活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)水平,比較兔肝移植瘤模型組不同時間外周血血小板活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)水平的變化,觀察各組實驗動

7、物血液循環(huán)中CD62P表達(dá)水平的差異,分析轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組CD62P表達(dá)水平的不同,所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計的t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。9、在瘤株成功種植后1w、2w各組分別處死并解剖15只實驗動物,肉眼觀察肝臟、肺內(nèi)有無轉(zhuǎn)移,觀察靜脈內(nèi)有無血栓形成；檢測轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組外周血血小板活化標(biāo)志CD62P的表達(dá)水平,比較轉(zhuǎn)移組及無轉(zhuǎn)移組間血小板活化標(biāo)志物表達(dá)水平的不同；分析有血栓形成組

8、與無血栓形成組外周血小板活化標(biāo)志物表達(dá)有無差異。
　　 結(jié)果:1、瘤株種植前各組外周血血小板活化標(biāo)志物呈低表達(dá)狀態(tài),各組均數(shù)對比P值分別為0.083△0.10▲0.088(),組間對比無明顯差異；2、瘤株種植后6h假手術(shù)組、肝移植瘤模型組外周血血小板活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)水平增加,假手術(shù)組與正常對照組比較P=0.01,肝移植瘤模型組與正常對照組比較P=0.012,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；肝移植瘤組與假手術(shù)組對比P=0.084,組間

9、對比無明顯變化；3、瘤株種植后48h,假手術(shù)組與正常對照組比較P=0.023,肝移植瘤組與正常對照組對比P=0.01,肝移植瘤組、假手術(shù)組血小板活化標(biāo)志物的表達(dá)水平高于正常對照組。肝移植瘤組與假手術(shù)組對比P=0.013差異有統(tǒng)計學(xué)意義,肝移植瘤組血小板活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)高于假手術(shù)組；4、瘤株種植后1w、2w時假手術(shù)組與正常對照組比較P值均大于0.05,組間對比無統(tǒng)計學(xué)意義；肝移植瘤組與正常對照組、假手術(shù)組對比P值均小于0.05,兔

10、肝移植瘤模型組外周血血小板活化標(biāo)志物水平明顯高于正常對照組及假手術(shù)組；5、肝移植瘤組外周血血小板活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)水平明顯高于正常對照組及假手術(shù)組,曲線圖示:瘤株種植后外周血小板活化標(biāo)志物表達(dá)水平隨著病程進(jìn)展逐漸上升；正常組與假手術(shù)組曲線,在不同的檢測時間外周血血小板活化標(biāo)志物表達(dá)水平變化不大；假手術(shù)組曲線在種植后6h、48h稍有上升,1w后逐漸恢復(fù),考慮與假手術(shù)組血小板活化標(biāo)志物表達(dá)的短暫增加與手術(shù)創(chuàng)傷引有關(guān),但其增加的幅度不大

11、；6、瘤株種植后1w、2w后腫瘤均有轉(zhuǎn)移,而且2w后檢測外周血CD62P表達(dá)水平明顯高于1w后,轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組對比P值均小于0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,轉(zhuǎn)移組的血小板活化標(biāo)志物表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移組；7、瘤株種植后1w、2w,肝移植瘤組血小板活化標(biāo)志物檢測數(shù)據(jù)對比,肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組與肺內(nèi)轉(zhuǎn)移組,肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組與肝內(nèi)、肺內(nèi)均轉(zhuǎn)移組及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移組與肝內(nèi)、肺內(nèi)均轉(zhuǎn)移組比值P值均大于0.05,組間數(shù)據(jù)對比變化不大；8、瘤株種植后1w、2w處死各組實驗動物1

12、5只,發(fā)現(xiàn)1w后肝移植瘤組靜脈血栓形成1例,2w后肝移植瘤組靜脈血栓形成8例,血栓形成率約為30％；1w后假手術(shù)組靜脈血栓形成1例,2w后未見血栓形成,考慮假手術(shù)組1例血栓形成與手術(shù)創(chuàng)傷所致凝血功能改變有關(guān)；正常對照組未見血栓形成。
　　 結(jié)論:1、兔VX2肝移植瘤瘤細(xì)胞與血小板相互作用,使血液循環(huán)中的血小板處于激活狀態(tài),其活化標(biāo)志物表達(dá)水平增加；2、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移伴隨著血小板活化,腫瘤中晚期外周血血小板活化標(biāo)志物表達(dá)水