西羅莫司抑制腎移植后AGEs誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：探討晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的相關(guān)分子機(jī)制及腎移植術(shù)后西羅莫司對AGEs誘導(dǎo)的VSMCs向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：體外分離和培養(yǎng)原代SD大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，進(jìn)行細(xì)胞傳代至第4～6代，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及間接免疫熒光染色法測定α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)表達(dá)以鑒定細(xì)胞是否具有VSMCs特性。取第5代SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs為體

2、外實(shí)驗(yàn)對象，用200 mg/L的AGEs或BSA分別作用VSMCs細(xì)胞不同時(shí)間(0h～12d);此外，部分細(xì)胞以2.0ug的pcDNA3.1或整合素鏈激酶(ILK)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h，或以抗AGE受體(RAGE)抗體預(yù)處理12h后，再予200 mg/L的AGEs或BSA處理9d，收集細(xì)胞，用蛋白質(zhì)印跡法檢測SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs上α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、骨橋蛋白(OPN)、ILK的表達(dá)變化，并以甲-酚酞絡(luò)合酮方法檢測該細(xì)胞中鈣

3、離子濃度的變化。同樣進(jìn)行體外分離和培養(yǎng)SD大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，以第5代大鼠主動(dòng)脈VSMCs為體外實(shí)驗(yàn)對象，根據(jù)處理方式的不同將細(xì)胞分為:西羅莫司組（西羅莫司處理）、AGEs組（AGEs處理）、西羅莫司+AGEs組（西羅莫司和AGEs共處理）及對照組（溶劑處理）。SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs經(jīng)10nm西羅莫司和或200mg/L AGEs處理9d后，收集細(xì)胞s，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測VSMCs中α-SMA、OPN、堿性磷酸

4、酶(ALP)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和整合素鏈激酶(ILK)的表達(dá);并以甲酚酞絡(luò)合酮方法檢測細(xì)胞鈣離子濃度。
　　結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下顯示第4～6代SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs的細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞無明顯差別;間接免疫熒光染色結(jié)果也顯示其α-SMA的表達(dá)強(qiáng)度與原代細(xì)胞相似。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:AGEs作用后SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs中α-SMA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性減少;同時(shí)，OPN表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加;且鈣離子濃度也具有AGEs濃度依賴

5、性增加趨勢(P＜0.05)。此外，與對照組相比，以AGEs處理SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs6h后，該細(xì)胞中ILK的表達(dá)顯著增加，在12h達(dá)高峰，24h始開始下降(P＜0.05);與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體(pcDNA3.1)的SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs相比，以野生型ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上調(diào)ILK表達(dá)后，可使該細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)明顯下降;而OPN表達(dá)則顯著增加，進(jìn)一步以AGEs作用此類細(xì)胞后，則使α-SMA表達(dá)進(jìn)一步降低，OPN表達(dá)進(jìn)一步增加。而

6、以抗RAGE中和抗體預(yù)處理細(xì)胞后，可抑制AGEs誘導(dǎo)的ILK表達(dá)增加（P＜0.05）。我們實(shí)驗(yàn)還顯示AGEs可抑制SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs中α-SMA表達(dá);誘導(dǎo)OPN、PCNA和ILK的表達(dá)上調(diào)、并使細(xì)胞中ALP表達(dá)及鈣離子濃度明顯增加(P＜0.05);而與AGEs組相比，西羅莫司預(yù)處理細(xì)胞后則可抑制AGEs介導(dǎo)的上述效應(yīng)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：AGEs可能通過與其受體----RAGE結(jié)合后激活I(lǐng)LK相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號通路進(jìn)而