柿子單寧的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及其與幾種蛇毒蛋白的相互作用研究.pdf

1、本文采用無水甲醇為提取溶劑從柿子果肉中提取單寧,通過考察提取劑種類、提取溫度、時間、提取次數(shù)及料液比等因素來確定了柿子單寧的最佳提取工藝；采用大孔樹脂101結(jié)合超濾分離實現(xiàn)了柿子單寧的分離純化及分級制備,得到了高分子量單寧(HMWT)和小分子量單寧(SMWT)兩個級分。采用高效液相-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-ESI-MS)對小分子結(jié)構(gòu)進行了初步鑒定；采用凝膠滲透色譜(GPC)、傅立葉紅外光譜(FT-IR)以及硫解和酸解結(jié)合HPLC-ES

2、I-MS等方法分析了HMWT分子量分布以及單體結(jié)構(gòu)；并對HMWT與SMWT在不同體系中的的抗氧化活性及HMWT與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用進行了系統(tǒng)研究；同時重點研究了HMWT在體外對江浙蝮蛇毒(AhPVP)、尖吻蝮蛇毒(AaVP)、眼鏡蛇毒(NnaVP)中蛋白酶活的抑制能力及體內(nèi)對AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的解毒效果；并結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳、紅外光譜(FT-IR)、圓二色譜(CD)初步研究了HMWT與蛇毒蛋

3、白的相互作用機理。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.柿子單寧的最佳提取工藝為:新鮮果肉去皮打漿后,以含1％HCL的無水甲醇作為提取介質(zhì),料液比1:12,90℃加熱回流提取,提取3次,每次40min。
　　 2.提取液經(jīng)大孔樹脂101除糖去雜,聚砜超濾膜分級得到紅色的HMWT粉末以及淡黃色SMWT粉末,HMWT縮合單寧(CT)含量93.4％,SMWT總酚(TP)含量為87.4％。兩者具有典型的酚類物質(zhì)顯色特征,易溶于水,乙醇,

4、甲醇等溶劑,其中HMWT在水中的最大溶解度為100mg/mL。
　　 3.經(jīng)HPLC-ESI-MS鑒定SMWT主要為沒食子酸及分子量分別為461,461,603的三個未知化合物。HMWT分子量分布在1.16×104u-1.54×1.04u之間,重均分子量1.39×104u,數(shù)均分子量1.28×104u,FT-IR表明HMW工具有原花青素的基本骨架結(jié)構(gòu),硫解和酸解的HPLC-ESI-MS表明其主要組成單體為:表沒食子兒茶素沒食子酸

5、酯(EGCG),表兒茶素沒食子酸酯(ECG),(表)沒食子兒茶素(E)GC及一種未知結(jié)構(gòu)的單體。
　　 4.HMWT在2-脫氧-D-核糖體系,甲基紫體系,水楊酸體系中對羥基自由基的最大抑制率分別為90.47％、96.46％和87.77％；對鄰苯三酚自氧化以及亞油酸脂質(zhì)過氧比的最大抑制能力分別為56.57％和69.63％。在所有的體系中HMWT的抗氧化能力與加入量呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,且HMWT的抗氧化能力要優(yōu)于相同濃度下的葡萄籽

6、原花青素,大大強于SMWT,是柿子單寧抗氧化作用的主導(dǎo)成分。
　　 5.HMWT與明膠和BSA均具有較強的結(jié)合能力,明膠、BSA與HMWT質(zhì)量比達到1.6:1時單寧沉淀率達到最大。HMWT與BSA結(jié)合的適宜條件為:溫度40℃,反應(yīng)時間30min,體系pH5.0,0.5mol/L的NaH2PO4為溶解介質(zhì)。熒光光譜和紫外吸收光譜法分析表明,HMWT可以有規(guī)律地使BSA內(nèi)源熒光猝滅,其猝滅機理可認為是HMWT與BSA形成復(fù)合物的靜態(tài)

7、猝滅、HMWT與BSA的作用力為疏水作用力和靜電作用力,同時由F(o)rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算得出HMWT與BSA結(jié)合位置的距離為1.63nm,結(jié)合位點0.99。
　　 6.HMWT溶液在光照、溫度大于60℃、pH大于7條件下穩(wěn)定性較差；具有較好的抗氧化性和抗還原性；食品添加劑中β-環(huán)狀糊精有利于增加HMWT的熱穩(wěn)定性、淀粉在溶液中含量超過0.5％時易與HMWT發(fā)生復(fù)合作用,檸檬酸三鈉對穩(wěn)定性有較大的影響,檸檬酸、EDT

8、A則影響較小；金屬離子中Fe3+,AL3+,Zn2+對HMWT有著較強的結(jié)合作用,Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+則影響較小。
　　 7.當蛇毒蛋白與HMWT質(zhì)量比為1:1時,HMWT對AhPVP、AaVP、NnaVP中蛋白質(zhì)水解酶、磷脂酶A2、L－氨基酸氧化酶、精氨酸酯酶、乙酰膽堿酯酶、類凝血酶的酶活均基本完全抑制,且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 8.HMWT對昆明小鼠腹腔注射的LD50值為301.84mg/

9、kg,具有良好的安全性。當蛇毒蛋白與HMWT質(zhì)量比為1:1時,HMWT對AhPVP,AaVP,NnaVP引起的肌肉毒性有極顯著(p<0.01)的抑制作用,肌酸激酶(CK)的酶活抑制率分別為63.30％,55.06％,61.82％,肌肉組織病理學觀察也顯示出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,高劑量組小鼠肌纖維損傷明顯好轉(zhuǎn)。當蛇毒蛋白與HMWT質(zhì)量比為1:1時,HMWT能夠極顯著(p<0.01)降低AhPVP,AaVP引起的皮下出血,出血抑制率分別為98

10、.6％,96.9％,HMWT對出血的抑制呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 9.5LD50劑量的AhPVP、AaVP、NnaVP注射入昆明小鼠腹腔后,口服灌胃HMWT后可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活時間分別延長4-6倍、3.5倍和2-4倍,高劑量的HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒小鼠存活率分別提高到75％、50％和25％。
　　 腹腔注射HMWT后可使AhPVP、AaVP和

11、NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活時間分別延長15－30倍、15－20倍和5－15倍,高劑量組對各種蛇毒的解毒作用強,小鼠存活率達100％。靜脈注射HMWT對小鼠的急救效果最佳,HMWT中劑量組即可使各組小鼠存活率達100％,低劑量組也能大大延長存活時間并且存活率分別達到了50％、75％、50％。三種解救方式對蛇毒引起的毒害均有急救效果,口服灌胃雖然存活率不高但能有效的延長存活時間,而腹腔注射和靜脈注射則能有效提高存活率。
　　

12、 口服預(yù)防給藥HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活時間分別延長3-5倍、3-5倍和1－3倍,說明服用HMWT對蛇毒引起的毒害有一定的預(yù)防作用。
　　 10.SDS-PAGE結(jié)果表明HMWT與蛇毒蛋白結(jié)合形成沉淀是導(dǎo)致酶失活的重要因為,雖然HMWT對蛇毒中蛋白質(zhì)組分的結(jié)合表現(xiàn)出一定的非特異性,但對不同組分結(jié)合能力和選擇性明顯不同,且為非可逆結(jié)合。AhPVP經(jīng)Sephadex G－75兩次純化及D