論文1-一11β-羥化酶缺陷癥家系分子致病機(jī)制研究;論文2-促甲狀腺激素對(duì)冠心病患者血脂水平的影響研究.pdf

1、本文分為二部分：
　　 論文1、一11β-羥化酶缺陷癥家系分子致病機(jī)制研究
　　 研究背景:
　　 先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的遺傳性疾病之一，屬于常染色體隱性遺傳性疾病，由皮質(zhì)激素合成酶基因突變致腎上腺皮質(zhì)類固醇激素合成障礙所引起。
　　 CAH是由于皮質(zhì)類固醇激素合成過程中任何一種酶先天性缺陷，引起腎上腺皮質(zhì)束狀帶合

2、成的皮質(zhì)醇完全或部分缺乏，經(jīng)下丘腦-垂體-腎上腺軸反饋調(diào)節(jié)，引起促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH-)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)分泌增加，導(dǎo)致了腎上腺皮質(zhì)增生，另一方面，某一酶的缺陷也使得皮質(zhì)醇生物合成鏈中缺陷酶近端的前體產(chǎn)物因不能繼續(xù)向下游合成而堆積，和雄激素的過度生成。CAH臨床主要特點(diǎn)為腎上腺皮質(zhì)功能不全，性腺發(fā)育異常，伴或不伴水鹽代謝紊亂，高血壓。本癥表現(xiàn)出女性男性化或性幼稚，男性假性性早熟或女性化，失鹽或非失鹽，高血壓等一系

3、列癥狀。
　　 典型CAH的發(fā)病率約為1/10000，而非典型的發(fā)病率約為典型的10倍，因其臨床表現(xiàn)錯(cuò)綜復(fù)雜，且對(duì)疾病認(rèn)識(shí)及實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)的不足，診斷方面尚存在許多困難，一般需要從臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室檢查和基因分析三方面進(jìn)行綜合診斷。目前CAH基因缺陷的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)沒有推廣，在我國(guó)臨床工作中尚未常規(guī)開展。
　　 11β-羥化酶缺陷癥(steroid11β-hydroxylase deficiency,11-OHD，OMIM:

4、+202010)是CAH中第二大類型，約占5～8％，發(fā)病率約為1/100，000至1/200，000。11β-羥化酶缺乏引起皮質(zhì)醇合成減少，對(duì)ACTH的反饋抑制減弱，使下丘腦和垂體分泌的CRH及ACTH增加，導(dǎo)致束狀帶產(chǎn)生更多的皮質(zhì)醇前體。這些前體物質(zhì)通過旁路代謝，在網(wǎng)狀帶產(chǎn)生大量雄激素，導(dǎo)致高雄激素血癥。此外，11-去氧皮質(zhì)酮和11-去氧皮質(zhì)醇水平升高，由于它們具有類鹽皮質(zhì)激素的作用，從而引起水鈉潴留、高血壓及低鉀血癥。11β-羥化酶

5、缺陷癥的臨床表現(xiàn)包括經(jīng)典型和非經(jīng)典型。經(jīng)典型11β-羥化酶缺陷癥患者可表現(xiàn)為女性外生殖器男性化，男、女患者都可出現(xiàn)的假性性早熟，由于生長(zhǎng)過快骨骺愈合提前引起身材矮小，以及血壓升高、血鉀降低。非經(jīng)典型在女性患者多表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂，多毛和痤瘡，類似多囊卵巢綜合征的表現(xiàn);在男性患者可無癥狀。
　　 由于11β-羥化酶缺陷癥的發(fā)病人數(shù)較少，其分子遺傳學(xué)研究相對(duì)較少?，F(xiàn)已證實(shí):11β-羥化酶缺陷癥的分子遺傳學(xué)缺陷是由于CYP11B1基因突變

6、所致。CYP11B1基因(GeneID:1584; MIM:610613; GenBank: NC_000008.10)位于第8號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的21區(qū)(8q21)，由9個(gè)外顯子組成(見圖1-6)，長(zhǎng)度為6.03Kbp，編碼503個(gè)氨基酸殘基。
　　 CYP11B1基因編碼11β-羥化酶，該酶屬于細(xì)胞色素P450蛋白超家族中的一員，在腎上腺束狀帶表達(dá)，位于線粒體內(nèi)膜，催化11-去氧皮質(zhì)醇和11-去氧皮質(zhì)酮分別轉(zhuǎn)變?yōu)槠べ|(zhì)醇和皮質(zhì)酮。

7、11β-羥化酶分子量約47kDa，是一種含有血紅素的蛋白，具有依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAPDH)的氧化還原體系，該體系由黃素蛋白——皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶及鐵硫蛋白——皮質(zhì)鐵氧還蛋白構(gòu)成。細(xì)胞色素P450蛋白家族的成員結(jié)構(gòu)高度保守，其核心結(jié)構(gòu)由一個(gè)被稱作“曲”的螺旋，一個(gè)由J螺旋和K螺旋組成的四螺旋束以及兩套β片層構(gòu)成。該結(jié)構(gòu)構(gòu)成了血紅素結(jié)合環(huán)、質(zhì)子傳遞溝和位于K螺旋的絕對(duì)保守的“EXXR”模序。
　　 CYP11B

8、1基因產(chǎn)生突變后可引起11β-羥化酶不能表達(dá)或表達(dá)減少，從而導(dǎo)致11β-羥化酶缺陷癥，并呈常染色體隱性遺傳。目前，已報(bào)道的CYP11B1基因突變達(dá)70余種，其中有錯(cuò)義/無義突變、剪接突變、小片段缺失、大片段缺失、插入突變及復(fù)雜重組（包括染色體倒位）。
　　 隨著科技進(jìn)步，應(yīng)用分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)，從分子水平對(duì)先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的發(fā)病機(jī)制和基因型——表型關(guān)系做進(jìn)一步闡明，這必將是研究的新的切入點(diǎn)，亦為研究的重點(diǎn)，從而為其

9、防治提供科學(xué)依據(jù)，以便更早地控制疾病的發(fā)生與發(fā)展，通過基因診斷及治療，降低其發(fā)病率，延緩疾病進(jìn)展。
　　 研究目的:本研究通過對(duì)一個(gè)11β-羥化酶缺陷癥家系中先證者及其家系成員CYP11B1基因的突變篩查，利用微小基因模型研究缺失突變的剪切機(jī)制，進(jìn)而探索該11β-羥化酶缺陷癥家系的分子遺傳學(xué)機(jī)制。
　　 研究方法:留取先證者及其他家系成員的外周血標(biāo)本，提取基因組DNA;根據(jù)基因庫中CYP11B1基因的序列，利用prime

10、r experss2.0軟件設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增該基因的9個(gè)外顯子及其周圍內(nèi)含子序列。以家系成員的基因組DNA分別作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后應(yīng)用美國(guó)ABI PRISM3700 DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，然后利用Autoassembler2.0軟件將測(cè)序結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫下載的基因組序列進(jìn)行比較、分析，找出突變位點(diǎn)。由于發(fā)現(xiàn)的是大片段缺失突變，缺失片段包含外顯子及內(nèi)含子的5'剪切供體位點(diǎn)，將影響mRNA的剪接，因此我們進(jìn)一步

11、利用小基因模型(minigen)技術(shù)進(jìn)行mRNA體外剪接研究，以明確該突變對(duì)11β-羥化酶的結(jié)構(gòu)和功能造成的影響。首先，我們將包含CYP11B1基因的第3-6外顯子的野生型及突變型片段構(gòu)建到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，測(cè)序證實(shí)后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，提取RNA，以特異引物進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并進(jìn)行比對(duì)分析。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、家系資料:先證者李登科，男性，4歲6個(gè)月，因“身高增長(zhǎng)過速2年半，乳腺及外生

12、殖器發(fā)育1年半，加重半年”就診。患者系足月順產(chǎn)，頭先露，出生時(shí)體重3.0kg，身長(zhǎng)55cm，無抽搐，母乳喂養(yǎng)?；颊哂?年半之前出現(xiàn)身高增長(zhǎng)過速，身高顯著高于同齡其他兒童，且飲食量增加，智力較同齡兒童無明顯差別。當(dāng)時(shí)未行診治。1年半之前出現(xiàn)乳腺及外生殖器發(fā)育，陰毛生長(zhǎng)，陰莖可勃起，無遺精，期間身高一直在增加，遂到當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，囑暫予觀察，未行其它特殊處理。半年前患者上述癥狀進(jìn)一步加重，遂于半個(gè)月前赴濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢查，查血鉀:2.60

13、mmol/L，血清FT3:8.23pmol/L，雌二醇:55.05pg/ml，促黃體生成素:＜0.100mIU/ml，促卵泡成熟激素:＜0.100mIU/ml，未行特殊治療，建議到上級(jí)醫(yī)院做進(jìn)一步檢查。查體:T36.7℃，P84次/分，R19次/分，BP143/93mmHg，H134cm，W29.5kg，神志清，反應(yīng)靈敏，會(huì)陰部皮膚顏色加深。無胡須，有喉結(jié)，兩乳房發(fā)育。雙肺呼吸音清，未聞及干濕性羅音。心率84次/分，律不齊，各瓣膜聽診區(qū)

14、未聞及病理性雜音。腹部平坦，未見腸型及蠕動(dòng)波，腹軟、無壓痛反跳痛，肝脾肋下未及，Murphy征陰性，肝區(qū)及腎區(qū)無叩擊痛，腸鳴音正常。外生殖器發(fā)育，陰莖及雙側(cè)睪丸增大，無尿道下裂，外陰部陰毛生長(zhǎng)。輔助檢查示:血堿性磷酸酶365U/L，總膽固醇2.31 mmol/L，鉀2.7mmol/L，肝功生化其他項(xiàng)目在正常范圍;甲功5項(xiàng)正常，β-HCG小于0.1mIU/ml, FSH0.23 mIU/ml, LH小于0.1 mIU/ml, E238.1

15、0 mg/ml, PRG1.56ng/ml，TO1.14 ng/ml，PRL9.94ng/ml，皮質(zhì)醇66.98nmol/L（8點(diǎn)），71.15nmol/L（16點(diǎn)），ACTH1534pg/ml（8點(diǎn)），582.8pg/ml（16點(diǎn)）。X線片:腕骨二次骨化中心出現(xiàn)8塊。尺、橈骨遠(yuǎn)端骨骺出現(xiàn)，但未閉合，掌指骨二次骨化中心出現(xiàn)，部分閉合，左膝骨骺未閉合。B超:前列腺發(fā)育，符合左腎上腺腺瘤聲像圖表現(xiàn)(左腎上腺低回聲結(jié)節(jié)，約0.8×0.7×0.

16、5cm)。最后診斷:先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥，11-β羥化酶缺陷癥并混合性性早熟?；颊吒改赶到H結(jié)婚，表型正常，患者有一姐姐，表型正常。
　　 2、CYP11B1基因突變篩查結(jié)果:經(jīng)過測(cè)序和序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CYP11B1基因的第3-5外顯子之間缺失449bp，患者為純合缺失，而其父母、姐姐為雜合缺失。缺失的片段包括:第3外顯子的3'端，全部?jī)?nèi)含子3和外顯子4，第4內(nèi)含子的5'剪切供體位點(diǎn)，其他外顯子測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。
　

17、　 3、致病機(jī)制研究結(jié)果:CYP11B1基因缺失突變(g.2697de1449)將導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA缺失部分3號(hào)外顯子和全部4號(hào)外顯子，同時(shí)插入部分4號(hào)內(nèi)含子序列，更重要的是，造成了從第167位氨基酸開始出現(xiàn)讀碼框改變，產(chǎn)生了大量錯(cuò)誤的密碼子，并在第217位氨基酸處產(chǎn)生了終止密碼，造成翻譯的CYP11B1蛋白出現(xiàn)提前終止，并完全破壞了該酶的血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使該酶的活性完全喪失。
　　 結(jié)論:通過對(duì)一個(gè)漢族11-β羥化酶缺陷癥

18、家系進(jìn)行突變篩查，我們?cè)趪?guó)際上首次發(fā)現(xiàn)了CYP11B1基因上一個(gè)新的大片段缺失突變(g.2697de1449)，通過小基因系統(tǒng)模擬mRNA剪接，發(fā)現(xiàn)該缺失突變導(dǎo)致產(chǎn)生截?cái)嗟牡鞍祝瑔适Я伺c血紅素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，造成11-β羥化酶功能完全喪失。CYP11B1基因缺失突變(g.2697de1449)是該11-β羥化酶缺陷癥家系的致病突變。
　　 論文2、促甲狀腺激素對(duì)冠心病患者血脂水平的影響研究
　　 研究背景：促甲狀腺激素（t

19、hyroid stimulating hormone, TSH）與促甲狀腺激素受體（TSHR）是人體內(nèi)參與甲狀腺功能調(diào)控的兩種重要蛋白分子。TSHR主要存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞膜上,生理情況下TSH與其結(jié)合后介導(dǎo)調(diào)節(jié)甲狀腺濾泡細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能。近年來的研究證實(shí),TSHR除存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞膜上外,尚存在于大腦、睪丸、腎臟、心肌、骨骼、胸腺、淋巴細(xì)胞、脂肪組織、纖維母細(xì)胞和肝細(xì)胞等多種甲狀腺外組織和細(xì)胞上。TSH可能通過TSHR介導(dǎo)發(fā)揮

20、著廣泛的、非傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)的功能作用,TSH的這種甲狀腺外作用受到了廣泛關(guān)注成為目前研究的熱點(diǎn)。甲狀腺功能減退癥（hypothyroidism,甲減）是“由于甲狀腺激素缺乏或其生理效應(yīng)不足所導(dǎo)致的機(jī)體代謝活動(dòng)下降,而引起的一種內(nèi)分泌疾病,實(shí)驗(yàn)室檢查表現(xiàn)為TSH升高,甲狀腺激素（FT3、FT4）降低”。甲狀腺功能減退癥常伴有血脂紊亂,易于出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化,增加心血管疾病的危險(xiǎn)性。亞臨床甲狀腺功能減退癥（subclinical hypothyro

21、idism,亞甲減）亦是一種常見的內(nèi)分泌專業(yè)亞臨床疾病,主要診斷依據(jù)是血清TSH水平增高,而血清FT3、FT4正常。亞臨床甲減患病率較高,社區(qū)調(diào)查的患病率為3％～15%不等,女性、老年和高碘攝入量地區(qū)的患病率明顯增加。美國(guó)Framingham隊(duì)列研究報(bào)告：女性13%,男性5.7%；英國(guó)Whickham前瞻研究報(bào)告：女性7.5%,男性2.8%。亞臨床甲減也常常伴有血脂紊亂,與動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性心臟病密切相關(guān)。既往人們一直認(rèn)為：甲狀腺功能

22、減退癥所伴隨的血脂紊亂是由于甲狀腺激素對(duì)血脂代謝的作用所致,但是,很顯然,亞臨床甲減所伴隨的血脂紊亂不能用甲狀腺激素的作用來解釋。促甲狀腺激素（TSH）在甲減及亞臨床甲減患者均明顯升高,但是其對(duì)血脂的影響目前研究較少。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–oronary heart disease）,簡(jiǎn)稱冠心病,是“因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞,或／和因冠狀動(dòng)脈功能性改變（痙攣）導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病”。
　　 近年

23、來,隨著人口老齡化及心血管病危險(xiǎn)因素的增加,冠心病的患病率和死亡率逐年升高,是全球死亡率最高的疾病之一,根據(jù)世界衛(wèi)生組織2011年的報(bào)告,中國(guó)的冠心病死亡人數(shù)己列世界第二位。由國(guó)家心血管病中心編制的《中國(guó)心血管病報(bào)告2011》指出：“目前我國(guó)心血管病患者人數(shù)約為2.3億,相當(dāng)于每10個(gè)成年人中有2人患病。對(duì)于我國(guó)心血管病未來發(fā)展趨勢(shì),報(bào)告根據(jù)中國(guó)冠心病政策模型作出預(yù)測(cè)：2010年到2030年,如果僅考慮人口老齡化和人口增加的因素,中國(guó)3

24、5歲至84歲人群中心血管病事件數(shù)將增加50%以上；如果考慮血壓、總膽固醇、糖尿病、吸煙的因素,心血管病事件數(shù)將額外增加23%。如果不改善應(yīng)對(duì)措施,2005年至2015年,心血管疾病、卒中和糖尿病將會(huì)給中國(guó)造成5500億美元的經(jīng)濟(jì)損失”。冠心病的病因至今尚未完全清楚,但其己知的危險(xiǎn)因素有許多,如高血壓、血脂異常如高膽固醇血癥和高低密度脂蛋白血癥、糖尿病與胰島素抵抗、年齡、吸煙、飲酒等,積極預(yù)防和治療冠心病的危險(xiǎn)因素,可降低冠心病患病率及死

25、亡率。近年來,許多臨床研究均顯示甲狀腺功能與冠心病關(guān)系密切,而且亞臨床甲狀腺功能減退能增加冠心病的發(fā)病率,是冠心病的重要危險(xiǎn)因素之一。因此,對(duì)冠心病患者進(jìn)行甲狀腺功能狀態(tài)分析對(duì)于預(yù)防和治療冠心病有著重要意義。我們前期基礎(chǔ)研究證實(shí)：肝臟細(xì)胞表面存在TSHR, TSH與其結(jié)合促進(jìn)肝臟合成膽固醇,在血膽固醇水平升高中發(fā)揮重要的作用。
　　 本研究通過對(duì)于冠心病患者甲狀腺功能和血脂水平的分析,著重研究冠心病患者中TSH變化和血清膽固醇水

26、平之間的關(guān)系,校正其他可能影響血脂的因素研究TSH和膽固醇之間關(guān)系,以期真實(shí)客觀的反映TSH和與血脂之間的關(guān)系。
　　 研究目的：探討冠心病患者的TSH水平和血脂譜之間的關(guān)系。
　　 研究方法：回顧性研究了1302例冠心病患者的資料,所有患者均經(jīng)過冠狀動(dòng)脈造影確診,并住院治療。經(jīng)過排除后,568例患者進(jìn)入研究。首先對(duì)冠心病患者的甲狀腺功能狀態(tài)進(jìn)行了分析,然后校正性別、年齡、血糖、吸煙狀況及甲狀腺激素水平等因素,應(yīng)用Pea

27、rson’s相關(guān)分析研究了TSH與血脂譜之間的關(guān)系。接下來,應(yīng)用線性回歸分析、通徑分析、主成分回歸分析及偏最小二乘法的方法分別研究了TSH水平對(duì)血膽固醇影響的程度。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、冠心病患者甲狀腺功能狀態(tài)分析顯示：冠心病患者中,甲狀腺功能異常的發(fā)生率是18.66%,其中甲狀腺功能減退癥（臨床型和亞臨床型）的發(fā)生率（15.32%）明顯高于甲狀腺功能亢進(jìn)癥的發(fā)生率（3.34%）,女性甲功異常的發(fā)生率（26.17

28、%）顯著高于男性（10.37%）。
　　 2、冠心病患者中,隨著TSH水平的升高,高膽固醇的發(fā)生率呈線性增高的趨勢(shì)（Pearson’s Chi-squared test, linear trend0.010, p<0.05）。
　　 3、當(dāng)我們校正性別、年齡、吸煙狀況、空腹血糖及甲狀腺激素的影響后,冠心病患者的TSH水平與血TC水平依然呈顯著正相關(guān)（r=0.095,p=0.036）。
　　 4、在冠心病患者中排除

29、性別年齡等因素的影響后,血清膽固醇隨著TSH水平的升高而升高。偏最小二乘法顯示：血清TSH每變化1各單位,血清膽固醇升高0.01558mmol/L。
　　 結(jié)論：TSH可以增加冠心病患者的血膽固醇水平。雖然TSH升高血膽固醇的作用較弱,但是仍然具有重要的生理作用及臨床意義。當(dāng)TSH水平升高,甚至在正常值高限時(shí),就會(huì)增加高膽固醇血癥的患病率。對(duì)冠心病患者來說,維持血TSH水平在合適的范圍,將有助于控制血脂,減緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。