RNA干擾下調(diào)骨癌痛大鼠脊髓背角PKCγ表達(dá)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)研究.pdf

1、研究背景：
　　 癌性疼痛是晚期癌癥患者最常見的癥狀之一，由于受到生理、情感、認(rèn)知、行為和社會文化等因素的影響，因而具有很大的易變性和主觀性。骨癌痛是一種性質(zhì)劇烈、燒灼樣且伴有嚴(yán)重負(fù)性情緒反應(yīng)的疼痛，常伴有骨折和其他骨骼相關(guān)性疾病的發(fā)生，并最終導(dǎo)致患者生活質(zhì)量的嚴(yán)重降低和死亡率的上升。目前對于骨癌痛的治療已有多種治療方法，如癌痛的三階梯治療方案、放療、化療以及手術(shù)等，但仍有很大一部分骨癌痛患者其疼痛程度沒能得到有效的緩解，同時(shí)這

2、些傳統(tǒng)的治療方法往往也伴有大量的副作用，例如阿片類藥物容易引起便秘、藥物成癮以及阿片類藥物治療過程中的認(rèn)知功能障礙等；放療及化療過程中在抑制或殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，對機(jī)體內(nèi)正常細(xì)胞也有毒害作用等等，因此極有必要尋求一種基于機(jī)制性的、力求能達(dá)到高效、作用持久、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)的新的治療方案。
　　 脊髓是外周傷害性信息傳遞及調(diào)控的初級中樞之一，尤其是脊髓Ⅱ?qū)?，在傷害性信息的傳遞、整合過程中發(fā)揮著重要的作用，觀察它們在中樞部位的投射及其

3、所含化學(xué)物質(zhì)的變化，對于闡明傷害性信息的傳遞和調(diào)控機(jī)制，具有重要意義。大量的研究結(jié)果表明，脊髓背角組織中的蛋白激酶Cγ（protein kinase Cγ，PKCγ）不僅僅參與了脊髓水平傷害性信息的傳遞與調(diào)制，而且促進(jìn)了脊髓敏化的形成和發(fā)展，在慢性疼痛的產(chǎn)生和/或維持中PKCγ可能發(fā)揮著重要的作用，因此若能有效降低PKCγ的表達(dá)，或許能夠獲得良好的鎮(zhèn)痛效果。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是近

4、幾年發(fā)展起來的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù) (post-transcriptional gene silencing，PTGS)，它利用小片段雙鏈RNA (double short RNA，dsRNA)即小干擾RNA（short interfering RNA，siRNA），特異性降解相應(yīng)序列的mRNA，從而高效、特異性的沉默相應(yīng)基因的表達(dá)。RNAi作為一種細(xì)胞水平的基因敲除工具，業(yè)已成為研究內(nèi)源性基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的有效手段，但如何能持久有

5、效地發(fā)揮其降解相應(yīng)序列mRNA的作用，仍是此技術(shù)面臨的最大障礙之一。
　　 慢病毒載體是常用的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，具有能感染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞的特性，一旦病毒與細(xì)胞結(jié)合,病毒的基因則可整合到細(xì)胞的基因組中,成為基因遺傳的穩(wěn)定組成部分,從而可在細(xì)胞的分裂過程中傳給子代，同時(shí)其致病基因已經(jīng)剔除，重組野生困難，因而用慢病毒載體表達(dá)siRNA能安全持久地發(fā)揮下調(diào)目的基因表達(dá)的作用，可用于離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)。
　　 基于以上理論基

6、礎(chǔ)，本研究擬通過以下四部分的研究，來評價(jià)siRNA干擾下調(diào)骨癌痛大鼠脊髓背角組織中PKCγ表達(dá)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)：１：制作骨癌痛大鼠模型，觀察PKCγ在骨癌痛大鼠脊髓背角組織中的表達(dá)變化及大鼠疼痛行為學(xué)的改變（包括機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間），探討PKCγ上調(diào)值與大鼠疼痛程度改變之間是否具有某種關(guān)系，以此初步探討PKCγ在骨癌痛的產(chǎn)生和/或維持中是否發(fā)揮了一定的作用；2：在第一部分研究的基礎(chǔ)上，將PKCγ特異性抑制劑GF109203X注入骨

7、癌痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，觀察PKCγ功能被抑制后，骨癌痛大鼠疼痛程度是否顯著減輕，從而推斷PKCγ在骨癌痛發(fā)病機(jī)制中的作用；3：根據(jù)大鼠PKCγ-mRNA序列，設(shè)計(jì)并構(gòu)建3個(gè)大鼠PKCγ基因的shRNA慢病毒載體，并在體外鑒定其干擾效率，篩選出一個(gè)有效的干擾靶點(diǎn)，為下一步試驗(yàn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)；4：將有效靶點(diǎn)的慢病毒載體注射到骨癌痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，評價(jià)其鎮(zhèn)痛效應(yīng)，為慢性疼痛的轉(zhuǎn)基因治療和siRNA的在體試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。
　　 研

8、究方法與結(jié)果
　　 1. 骨癌痛大鼠脊髓背角蛋白激酶Cγ表達(dá)的變化及意義方法: 選取成年雌性Wistar大鼠64只，隨機(jī)分為三組，正常對照組（Naive組，n=16）：未作任何處理的健康大鼠；假手術(shù)組（Sham組，n=16）：大鼠右側(cè)脛骨上段骨髓腔注射熱滅活的Walker256細(xì)胞10μl；骨癌痛模型組（Cancer-induced bone pain，CIBP組，n=32）：大鼠右側(cè)脛骨上段骨髓腔注入Walker256細(xì)胞10

9、μl (4×104 cells)制作骨癌痛模型。模型制作前一天及術(shù)后21天內(nèi)每隔3天觀察各組大鼠疼痛行為學(xué)變化（包括機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間），且各組大鼠分別在術(shù)前一天（-1d）及手術(shù)后第6、15、21天灌注后取脊髓L4～6節(jié)段組織(每個(gè)時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選擇4只)，冰凍切片后作免疫組織化學(xué)DAB染色以檢測脊髓背角組織中PKCγ的表達(dá)；同時(shí)對骨癌痛模型組大鼠于術(shù)前一天及手術(shù)后第6、15、21天，各選4只大鼠取脊髓L4～6節(jié)段組織作Weste

10、rn blot分析以檢測PKCγ的表達(dá)變化，探討PKCγ上調(diào)值與時(shí)間相關(guān)的大鼠疼痛程度改變之間是否具有某種關(guān)系。
　　 2. 鞘內(nèi)注射PKCγ抑制劑GF109203X對骨癌痛大鼠痛覺的影響方法：選取成年雌性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為五組（每組6只），對照組（Naive組）：隨機(jī)選取6只正常大鼠且不做任何手術(shù)；骨癌痛模型組（Cancer-induced bone pain，CIBP組）：構(gòu)建骨癌痛模型后，鞘內(nèi)不注入任何藥物；

11、CIBP+生理鹽水組（Normal Saline，NS組）：構(gòu)建骨癌痛模型后，鞘內(nèi)注入生理鹽水10 μL；CIBP+二甲基亞砜組（Dimethylsulfoxide，DMSO組)：構(gòu)建骨癌痛模型后，鞘內(nèi)注入DMSO10 μL；CIBP+GF109203X（GF109203X組)：構(gòu)建骨癌痛模型后，鞘內(nèi)注入PKCγ抑制劑GF109203X 10 μL。觀察各組大鼠注藥前及鞘內(nèi)注藥后15、30、45、60、75 min時(shí)的疼痛行為學(xué)變化（包

12、括機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間）；各組大鼠分別在疼痛觀察結(jié)束后取脊髓L4～6節(jié)段組織，采用免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠腰段脊髓背角PKCγ的表達(dá)變化，探討PKCγ在骨癌痛發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 3. 大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其干擾效率的鑒定方法：根據(jù)PKCγ-mRNA序列，選擇3條19nt的靶序列，設(shè)計(jì)并合成包含正、反義靶序列的互補(bǔ)DNA鏈，退火后插入到pLVTHM載體的H1啟動(dòng)子后獲得重組質(zhì)粒（pLV-

13、PKC1、pLV-PKC2、pLV-PKC3），同時(shí)構(gòu)建一個(gè)非特異性對照質(zhì)粒（pLV-Con）。將所構(gòu)建的質(zhì)粒與質(zhì)粒pMDLg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，再將成功包裝的慢病毒分別感染培養(yǎng)的C6細(xì)胞，經(jīng)免疫印跡技術(shù)(Western blot）檢測PKCγ基因的蛋白表達(dá)水平以評價(jià)慢病毒載體的抑制效率。結(jié)果：測序證實(shí)成功構(gòu)建了三個(gè)大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒載體，在分別感染C6細(xì)胞后，慢病毒

14、pLV-PKC2、pLV-PKC3可明顯抑制PKCγ蛋白的表達(dá)水平，其中以慢病毒pLV-PKC2 (靶向+1913-+1931位點(diǎn))的抑制效率最高。
　　 4. 鞘內(nèi)給予PKCγ-shRNA慢病毒載體對骨癌痛大鼠痛覺的影響方法：選取24只成年雌性Wistar大鼠制作骨癌痛模型，術(shù)后第7天經(jīng)鞘內(nèi)置管后將模型大鼠隨機(jī)分為4組：CIBP組（鞘內(nèi)不注入任何藥物）、PBS組（鞘內(nèi)注入10μl PBS）、pLV-Con組（鞘內(nèi)注入10μl

15、慢病毒pLV-Con）和pLV-PKC2組（鞘內(nèi)注入10μl 慢病毒pLV-PKC2）。于模型制作前，以及模型制作后每隔3天分別測定大鼠機(jī)械縮爪閾值和縮爪持續(xù)時(shí)間；各組大鼠在疼痛觀察結(jié)束后取脊髓L4～6節(jié)段組織，采用免疫組織化學(xué)方法、Western blot方法，檢測各組大鼠腰段脊髓背角PKCγ的表達(dá)變化，探討慢病毒載體pLV-PKC2在在體水平能否特異、有效地抑制大鼠PKCγ基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其對骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
　　

16、 5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，機(jī)械縮爪閾值和機(jī)械縮爪持續(xù)時(shí)間采用重復(fù)變量數(shù)據(jù)的方差分析，其余結(jié)果比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究總結(jié)
　　 一、主要研究結(jié)果
　　 1.本研究通過疼痛行為學(xué)觀察和免疫學(xué)檢測表明，骨癌痛模型大鼠復(fù)制成功后，其脊髓背角PKCγ的表達(dá)量顯著增加，且與疼痛程度的改變之間具有明顯的正相關(guān)關(guān)

17、系。
　　 2.骨癌痛大鼠鞘內(nèi)注射PKCγ抑制劑GF109203X后，PKCγ的功能被抑制并產(chǎn)生了顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，說明PKCγ在骨癌痛的產(chǎn)生和/或維持中發(fā)揮了重要的作用。
　　 3.根據(jù)PKCγ基因mRNA序列，設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建出3個(gè)大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒載體，其中慢病毒載體pLV-PKC2能在蛋白水平上特異、高效地抑制PKCγ基因的表達(dá)。
　　 4.骨癌痛大鼠鞘內(nèi)注射慢病毒pLV-PKC2后，其脊