絲素蛋白基大孔微載體共培養(yǎng)C3A細(xì)胞治療大鼠急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝臟是人體最重要的臟器之一，擔(dān)負(fù)著人體分泌膽汁、凝血、新陳代謝、吞噬或免疫作用、解毒、調(diào)節(jié)水與電解質(zhì)等一系列復(fù)雜的生理功能。急性肝功能衰竭是以快速進(jìn)展的嚴(yán)重肝功能損害引起嚴(yán)重肝功能不全疾病，嚴(yán)重危及人類生命。各種原因引起的急性肝功能衰竭，常規(guī)治療病死率高達(dá)60-80％。目前臨床上急性肝功能衰竭的有效治療手段主要包括三種:原位肝移植、生物人工肝支持系統(tǒng)以及肝細(xì)胞移植。隨著肝臟移植技術(shù)的發(fā)展及免疫抑制劑的使用，目前

2、肝臟移植已經(jīng)被認(rèn)為是治療各種終末期肝病及急性肝衰竭唯一有效的治療手段。但因?yàn)楦纹鞴僖浦彩艿焦w器官短缺、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大、治療費(fèi)用高、術(shù)后免疫排斥導(dǎo)致供肝功能喪失以及終生需要服用免疫抑制劑治療等因素的限制，決定了其在我國廣泛應(yīng)用仍有一定的困難。以體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞為核心構(gòu)建的生物型人工肝支持系統(tǒng)是一種理想的替代治療方法，但是因生物反應(yīng)器價(jià)格昂貴、供肝細(xì)胞來源以及其治療過程中可能產(chǎn)生的血流動(dòng)力學(xué)紊亂等因素制約了其臨床廣泛應(yīng)用。肝細(xì)胞移植具有技術(shù)簡

3、單，容易操作，對患者創(chuàng)傷小、費(fèi)用相對低廉、肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)后減少了細(xì)胞表面的抗原性，可以降低免疫排斥反應(yīng)、移植肝細(xì)胞可以發(fā)揮肝臟解毒、合成功能等特殊優(yōu)勢。相關(guān)試驗(yàn)研究已證明肝細(xì)胞移植可延長急性肝衰竭患者供體等待時(shí)間，明顯改善患者的肝功能水平，由于肝臟的再生能力和潛力很大，在接受肝細(xì)胞移植后，部分患者殘存的肝臟得以再生，肝功能可以恢復(fù)至正常水平。因此，肝細(xì)胞移植已被認(rèn)為是對終末期肝疾病及急性肝衰竭的一種具有良好發(fā)展前景的治療方法。但是，它

4、需要解決的問題仍有很多，主要包括細(xì)胞來源問題和高密度高活性肝細(xì)胞培養(yǎng)問題。肝細(xì)胞的質(zhì)與量是肝細(xì)胞移植研究中的關(guān)鍵問題，如何方便地獲取高密度、高質(zhì)量、高活性的肝細(xì)胞已成為肝細(xì)胞移植成功需要解決的重要問題。以生物支架材料大孔微載體為核心的三維肝細(xì)胞培養(yǎng)有望解決此難題。主要利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞的高密度培養(yǎng)及擴(kuò)增，使細(xì)胞在數(shù)量上及功能上都能達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種子細(xì)胞的擴(kuò)增和用來充當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞治療的傳輸載體

5、，近年來在肝細(xì)胞移植、生物人工肝及組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究正日趨升溫。相比于實(shí)心微載體，大孔微載體的明顯優(yōu)勢在于為細(xì)胞生長、粘附、增殖提供了足夠的空間和更大的面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入和代謝產(chǎn)物的排出，從而提高了細(xì)胞代謝活性和培養(yǎng)密度。然而，目前市售的微載體的主要成分多見于明膠、葡聚糖、纖維素等，缺乏肝細(xì)胞特異性，細(xì)胞生長較為緩慢，不容易黏附于微載體表面;而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞容易脫落、死亡，從而降低了細(xì)胞培養(yǎng)密度和活性。隨著對組織

6、工程支架材料的深入研究，研究人員發(fā)現(xiàn)對高分子材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)改性、表面修飾等處理，以增強(qiáng)其力學(xué)特性，生物相容性及肝特異性，可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在支架上的黏附和增殖行為。在肝組織工程支架方面，半乳糖基是肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的特異性配體，是肝細(xì)胞識別的相應(yīng)位點(diǎn)并能產(chǎn)生特異性相互作用。以半乳糖基修飾各種天然原材料的和人工聚合物，通過聚合物鏈上的半乳糖基和肝細(xì)胞表面去

7、唾液酸糖蛋白受體之間獨(dú)特的分子識別功能，優(yōu)化支架的肝細(xì)胞特異性，提高肝細(xì)胞的特異功能。在肝組織工程細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上接枝半乳糖基，可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架上的粘附和增殖行為。我們的前期研究工作中，以生物相容性良好的天然高分子材料絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸為原料，把半乳糖基引入殼聚糖中，應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)將絲素蛋白與半乳糖基化殼聚糖復(fù)合，經(jīng)過極性溶液處理、冷凍干燥等處理，制備出了一種肝細(xì)胞特異性絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載

8、體。成功建立了絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體制備技術(shù)，掃描電子顯微鏡觀察該大孔微載體表面及內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu)，開口向外，呈喇叭狀，孔的分布均勻，適合于肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)。并通過1HNMR譜、FITR譜表征，證實(shí)半乳糖基已經(jīng)成功接枝到支架材料之中。該支架材料中引入了肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的特異性配體—半乳糖基，成功制備出了一種具有肝細(xì)胞特異性的高性能的大孔微載體。體外絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體與肝細(xì)胞系C3A細(xì)胞

9、懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明肝細(xì)胞能與大孔微載體特異性黏附、細(xì)胞圍繞微載體聚集生長，并表現(xiàn)出很好的活力。然而，體內(nèi)環(huán)境相對于體外環(huán)境更為復(fù)雜， SF/GC大孔微載體C3A細(xì)胞復(fù)合物在體內(nèi)能否有效存活？能否對動(dòng)物急性肝衰竭模型進(jìn)行有效的提高生存率、改善肝功能、減輕肝臟損傷？這些問題的深入探討無疑將有助于細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展。基于研究現(xiàn)狀以及本課題組前期的工作結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)擬采用絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體C3A細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成的復(fù)合物腹腔內(nèi)移植的方

10、法，以觀察SF/GC大孔微載體C3A細(xì)胞復(fù)合物對急性肝功能衰竭的治療效果。本研究旨在探討SF/GC大孔微載體C3A細(xì)胞復(fù)合物在動(dòng)物急性肝衰模型體內(nèi)移植的可行性，為今后臨床上更好的應(yīng)用細(xì)胞移植技術(shù)治療急性肝衰竭提供必要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：
　　 以肝細(xì)胞系C3A細(xì)胞為移植細(xì)胞，以絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體為載體，對C3A細(xì)胞行大孔微載體粘附培養(yǎng)、檢測其生物學(xué)特性，探討將絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微

11、載體粘附培養(yǎng)C3A細(xì)胞復(fù)合物植入到切除80％肝組織的急性肝功能衰竭大鼠模型腹腔內(nèi)，觀察存活率，檢測肝功能水平及觀察肝臟組織學(xué)變化，評價(jià)其對急性肝衰大鼠的治療效果，為將來臨床應(yīng)用提供必要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 首先采用冷凍干燥法制備絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體，與肝細(xì)胞系C3A細(xì)胞進(jìn)行粘附共培養(yǎng)，對其生物相容性及細(xì)胞功能進(jìn)行檢測，確定行大孔微載體C3A復(fù)合體移植的最佳時(shí)期。然后切除大鼠80％肝臟組織構(gòu)

12、建SD大鼠急性肝功能衰竭模型。最后大鼠肝衰模型建立后分別將培養(yǎng)72h的絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體C3A細(xì)胞復(fù)合物（A組）、C3A細(xì)胞懸液2mL(含6.0×107個(gè)C3A細(xì)胞，B組)植入到急性肝功能衰竭大鼠腹腔內(nèi)。觀察移植后大鼠1周內(nèi)存活率，檢測血清白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)肝功能指標(biāo)，檢查肝臟組織學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 大孔微載體C3A細(xì)胞共培養(yǎng)第3天上清液中葡萄糖消耗及

13、白蛋白濃度最高。絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體C3A細(xì)胞復(fù)合物對急性肝衰竭模型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)顯示，移植后1周急性肝衰竭大鼠的存活率分析比較:微載體組動(dòng)物的生存率明顯高于其他兩組，A組為50％，B組為40％，C組為10％，各移植組高于對照組(P＜0.05)。移植后1周內(nèi)，微載體組肝功能各項(xiàng)指標(biāo)水平逐漸下降，移植術(shù)后第7天肝功能各項(xiàng)指標(biāo)逐漸接近正常水平，與移植第1日有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。對照組肝功能各項(xiàng)指標(biāo)水平無明顯下降趨勢，A

14、LT水平于移植術(shù)后第1日達(dá)最高峰。肝組織切片形態(tài)學(xué)觀察示大孔微載體C3A細(xì)胞復(fù)合物組移植第7天后肝臟病理有不同程度的恢復(fù)，較其他兩組有明顯改善。
　　 結(jié)論：
　　 以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸為原料制備的絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體表面及內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，孔的分布均勻，具有肝細(xì)胞特異性，適合肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)，是較為理想的細(xì)胞載體材料。大孔微載體與C3A細(xì)胞共培養(yǎng)能更好的維持培養(yǎng)的C3A細(xì)胞活性及功能，以第3天的功能