梨S基因芯片的試制及分子雜交條件的初步研究.pdf

1、梨是典型的配子體自交不親和植物,自花授粉座果率低。梨自交不親和性由單一基因位點的S復(fù)等位基因所控制。在梨栽培中,必須配置S基因型不同的授粉品種才能保證正常的授粉受精和豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),因此,確定梨品種的S基因型是梨栽培、育種(特別是雜交育種)的重要科學(xué)依據(jù)。我國梨品種S復(fù)等位基因豐富,目前只有少數(shù)品種的S基因型已被確定。現(xiàn)今國內(nèi)外主要運用PCR-RFLP技術(shù)、DNA序列測定技術(shù)、cDNA克隆及序列分析方法等方法結(jié)合雜交授粉試驗來確定S基因型,這

2、些方法工作量大且檢測單個樣本的S基因型成本較高,自動化程度低。因此開發(fā)一種更有效、更直接、簡化的方法,用于梨品種自交不親和基因型的確定十分必要。應(yīng)用寡核苷酸芯片技術(shù)鑒定梨品種或其他植物品種S基因型國內(nèi)外尚未見報道。本實驗針對梨S-RNase基因的結(jié)構(gòu)特點選擇性地設(shè)計了部分S-RNase特異的寡核苷酸探針試制成梨自交不親和性基因型檢測寡核苷酸芯片,并對運用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測梨品種S基因型進行了初步的方法學(xué)上的探索,主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　 1.利用“FTQQYQ”(P1)和“anti-IIWPNV”(P2)Cy3熒光標記特異引物法分別對各品種的S基因片斷進行PCR擴增,并純化PCR產(chǎn)物,獲得熒光標記的芯片檢測的靶序列。
　　 2.根據(jù)GenBank及相關(guān)文獻的數(shù)據(jù)資料,結(jié)合本實驗室的研究成果,按照寡核苷酸探針設(shè)計原則選擇性地設(shè)計了7條32mez特異的s基因寡核苷酸探針,探針合成時對5’端進行氨基修飾。
　　 3.以0.1M pH=9碳酸緩沖液作

4、為點樣液,調(diào)整探針的終濃度為100uM,將寡核苷酸探針手動點樣在醛基玻片上,制成梨S基因寡核苷酸檢測芯片,用已知S基因型的梨品種的擴增片段與芯片雜交,獲得有效的雜交信號。
　　 4.為保證雜交的特異性,針對影響雜交信號的諸多因素從雜交時間、雜交溫度及PCR產(chǎn)物濃度等方面對雜交體系進行了優(yōu)化。實驗結(jié)果表明,47℃條件下,100ng/μL的梨品種PCR產(chǎn)物與雜交液混合(PCR產(chǎn)物:雜交液:滅菌水=1:1:1)與芯片雜交4小時,可獲得

5、交好的雜交信號。
　　 5.用寡核苷酸芯片分別對黃花、桂冠、黃金、鮮黃、大核白等S基因型已知的梨品種進行檢測,芯片信號掃描結(jié)果顯示檢測結(jié)果與各品種的已知基因型完全相符,各品種重復(fù)雜交2次。雜交結(jié)果完全一致,表明寡核苷酸芯片特異性好,芯片檢測結(jié)果準確可靠。
　　 本實驗的研究結(jié)果證明梨S基因寡核苷酸檢測芯片檢測梨品種所包含的S-RNase基因和基因型是一種切實可行的檢測方法。如果進一步將所有S-RNase基因的特異性探針集