16S rRNA基因熒光定量PCR-基因芯片雜交法的建立及其應用研究.pdf

1、新生兒敗血癥(neonatalsepsis)發(fā)病隱匿，臨床癥狀無特異性，存活者有相當一部分發(fā)生后遺癥。因此，尋找快速、敏感而特異的新生兒敗血癥早期診斷指標，對指導臨床治療、降低新生兒死亡率、改善預后，具有十分重要的意義。在本研究中，分析細菌16SrRNA基因序列，在其保守區(qū)設計引物和探針，進行熒光定量PCR與基因芯片雜交分析，最終建立了細菌16SrRNA基因熒光定量PCR與基因芯片雜交相結合的方法快速檢測細菌DNA，并對臨床標本進行檢測

2、取得良好效果。本研究分二部分： 第一部分16SrRNA基因熒光定量PCR—基因芯片雜交技術的建立方法： 在細菌的16SrRNA基因保守區(qū)域設計通用引物，并在該引物的擴增的區(qū)域內(nèi)設定一條通用熒光探針。對陽性標準菌株組、陰性對照組進行熒光定量PCR檢測、分析。同時在細菌16rRNA基因保守區(qū)設計引物，設置區(qū)分革蘭氏陰性菌、陽性菌與其他特異性菌屬的探針，制成基因芯片，通過對標準菌株、陰性對照組進行芯片熒光雜交、洗脫、掃描，最后

3、進行分析。 結論:FQ-PCR檢測靈敏度高；耗時少；不受標本中存在抗菌藥物或其他抑菌物質(zhì)的干擾；定量分析準確，有助于評價治療效果、判斷預后，有效解決了PCR污染問題。基因芯片其雜交敏感性高，能檢出特殊培養(yǎng)，難以培養(yǎng)等細菌；可檢測任何無菌體液，如血、腦脊液、胸水等；最快4小時檢測，具有高通量性，多種項目可一次檢測。此項復合方法可為細菌感染的早期、快速診斷提供新的有效手段。 第二部分16SrRNA基因熒光定量PCR—基因芯片

4、雜交技術的臨床應用研究方法： 本院新生兒、重癥監(jiān)護室(ICU)、15病區(qū)綜合病房臨床擬診為化膿性腦膜炎的住院患兒標本49例，每例均抽取腦脊液2ml，其中1ml作腦脊液細菌培養(yǎng)，1ml作細菌DNAFQ-PCR測定及芯片雜交。同時對臨床疑為敗血癥的住院患兒830例標本，每例抽取靜脈血各1ml分別行血培養(yǎng)和細菌16SrRNA基因FQ-PCR—基因芯片雜交檢測。 結論：熒光定量PCR陽性的標本其基因芯片雜交結果與血液培養(yǎng)結果基本