應(yīng)用熒光定量RT-PCR法檢測mdr-1基因的表達(dá).pdf

1、[目的]建立用實(shí)時熒光定量RT—PCR法在mRNA水平上檢測腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥基因(mdr-1基因)表達(dá)的方法，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞中mdr-1mRNA快速，準(zhǔn)確的檢測，對臨床治療和腫瘤預(yù)后判斷提供輔助手段。 [材料與方法] 1．細(xì)胞培養(yǎng)：用含10％小牛血清的RPMLl640培養(yǎng)基對乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR于孵箱內(nèi)單層連續(xù)傳代培養(yǎng)，用0.25％的胰酶及0.25％的EDTA用直接吹打法傳代。 2．細(xì)胞和

2、組織總RNA提?。河肂iozol試劑分別提取乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR細(xì)胞和人乳腺癌腫瘤組織中的總RNA。 3．cDNA的合成：以所提取的乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR及人乳腺癌腫瘤組織所提取的RNA為原料分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。 4．PCR反應(yīng)及重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收法進(jìn)行純

3、化。用PGEM—T Easy質(zhì)粒載體連接PCR純化產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒。 5．熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，并以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立檢測mdr-1 mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6．用所建立的熒光定量PCR方法對58例乳腺癌標(biāo)本中mdr-1 mRNA的含量進(jìn)行測定，同時用免疫組化的方法檢測標(biāo)本中P-gP的表達(dá)，兩種方法進(jìn)行比較，采用X<'

4、2>檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 [結(jié)果]構(gòu)建了mdr-1基因的重組質(zhì)粒，并且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選提取重組質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，以稀釋的質(zhì)粒為模板優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，建立最佳熒光定量PCR體系，并以已知濃度的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建了定量測定mdr-1mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對所建立的熒光定量PCR體系進(jìn)行靈敏度和重復(fù)性測定，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CR反應(yīng)體系可穩(wěn)定的檢測出40μ1反應(yīng)體系中1

5、0<'2>拷貝數(shù)的質(zhì)粒模板。五次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，每次實(shí)驗(yàn)的平均Ct值分別是22.80、22.96、22.73、22.89、22.81，其組內(nèi)變異系數(shù)分別為0.6％、0.4％、0.5％、0.6％和0.6％，組間變異系數(shù)為0.5％。用此熒光定量PCR方法和免疫組化法分別對58例乳腺癌組織進(jìn)行檢測，陽性率分別為72.4％和58.6％，兩者相比較結(jié)果有顯著性差異(P<0.001)。 [結(jié)論]本實(shí)驗(yàn)建立了熒光定量RT-PCR法定量測定腫瘤細(xì)