基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析平臺(tái)的構(gòu)建、優(yōu)化及應(yīng)用.pdf

1、多重基因表達(dá)分析是從轉(zhuǎn)錄水平上篩選、明確功能基因的有效方式。目前,表達(dá)分析技術(shù)包括高通量、低準(zhǔn)確率的cDNA芯片與高精度、低通量的real-time qPCR技術(shù),尚缺乏中等通量(10~30)、較高精度的表達(dá)監(jiān)控體系。
　　本文建立并優(yōu)化了一種基于熒光通用引物的中等通量多重定量RT-PCR技術(shù)。該技術(shù)采用了嵌合特異引物引導(dǎo)熒光通用引物擴(kuò)增的方案,前幾個(gè)循環(huán)嵌合特異引物使目的基因待擴(kuò)序列的兩端加上了通用引物序列,在接下來(lái)的循環(huán)過(guò)程高

2、濃度的通用引物取代了嵌合特異引物完成整個(gè)PCR反應(yīng)。從多對(duì)嵌合特異引物的PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粚?duì)通用引物的PCR反應(yīng)大大降低了PCR反應(yīng)的復(fù)雜性,并且所有待擴(kuò)目的基因片段也在一對(duì)通用引物的作用下被等比例的擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)多重定量檢測(cè)。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)可靠的中通量基因表達(dá)定量研究,彌補(bǔ)了基因表達(dá)分析平臺(tái)中cDNA芯片定量準(zhǔn)確性低和real-time qPCR通量小的缺點(diǎn),完善了整個(gè)基因表達(dá)的分析過(guò)程。前期的研究通過(guò)全基因組掃描和特異區(qū)段同類系分

3、析發(fā)現(xiàn)在小鼠的X染色體上存在一個(gè)與小鼠性發(fā)育啟動(dòng)時(shí)間相關(guān)的QTL區(qū)段,本研究以該QTL區(qū)段為例,選擇了11個(gè)目的基因進(jìn)行了技術(shù)構(gòu)建及優(yōu)化,包括以下三方面的內(nèi)容:引物序列設(shè)計(jì)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和多重PCR反應(yīng)系統(tǒng)。引物序列設(shè)計(jì)上完成了通用引物和包括看家基因在內(nèi)的14對(duì)基因嵌合特異引物的序列設(shè)計(jì);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的研發(fā)過(guò)程中,主要考察了下游嵌合特異引物的量,逆轉(zhuǎn)錄延伸時(shí)間;多重PCR體系的研發(fā)過(guò)程中,主要考察了通用引物與上游嵌合特異引物的用量比

4、,PCR反應(yīng)程序優(yōu)化(Mg2+濃度、退火時(shí)間、延伸時(shí)間等),降落式(Touchdown,TD)PCR結(jié)合通用引物補(bǔ)加方案和最低模板檢測(cè)靈敏度等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該技術(shù)的檢測(cè)靈敏度為102拷貝,通用引物與上游嵌合特異引物的比例以1:1為佳,并且驗(yàn)證了該技術(shù)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。降落式(Touchdown)PCR結(jié)合通用引物補(bǔ)加實(shí)驗(yàn)表明,該優(yōu)化步驟可大大改善低豐度表達(dá)基因的擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)2個(gè)品系(C3H/HeJ和C57BL/6J)15日齡小鼠的下丘