熒光定量RT-PCR檢測有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽OATP-E基因表達(dá)的方法學(xué)研究.pdf

1、[目的]探討人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-EmRNA在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中的表達(dá);建立熒光定量RT-PCR檢測腫瘤細(xì)胞OATP-E基因表達(dá)的方法并繪制出外標(biāo)準(zhǔn)曲線，為基礎(chǔ)研究、臨床治療和藥物篩選提供針對人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-E方面研究的有效手段。 [材料與方法] 1.細(xì)胞培養(yǎng)：以含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株

2、MCF-7和對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR，傳代待其生長穩(wěn)定后分別提取細(xì)胞總RNA待用。 2.細(xì)胞總RNA的提?。河肨rizol試劑分別提取乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR的細(xì)胞總RNA。 3.RT-PCR反應(yīng)：以所提取的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的細(xì)胞總RNA為原料，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得編碼人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-E的cDNA并進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。 4.

3、構(gòu)建克隆載體pGEM-OATP-E標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒：提取并純化PCR產(chǎn)物，與pGEM-TEasyVector質(zhì)粒載體相連接，構(gòu)建克隆載體pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細(xì)胞。 5.外標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：采用藍(lán)白斑染色方法篩選并提取pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒，并將該pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒定量后作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測OATP-EmRNA的外標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6.采用本實(shí)

4、驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法及其外標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測OATP-EmRNA在對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中的表達(dá)，并與乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中OATP-EmRNA的表達(dá)作比較。用SPSS11.5軟件包對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 [結(jié)果]RT-PCR方法證實(shí)人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-EmRNA在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中有表達(dá)；構(gòu)建了克隆載體pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒，并

5、且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)藍(lán)白斑篩選后提取pGEM-OATP-E重組質(zhì)粒并將其作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測腫瘤細(xì)胞OATP-E基因表達(dá)的方法并繪制出外標(biāo)準(zhǔn)曲線；采用此方法和外標(biāo)準(zhǔn)曲線分別成功檢測出乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中OATP-EmRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中OATP-EmRNA的表達(dá)量要比不耐藥的乳腺癌細(xì)胞株M

6、CF-7中OATP-EmRNA的表達(dá)量降低，二者相比結(jié)果有顯著性差異(P＜0.05)。 [結(jié)論]本實(shí)驗(yàn)建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測腫瘤細(xì)胞OATP-E基因表達(dá)的方法，檢測結(jié)果用絕對拷貝數(shù)表示，定量準(zhǔn)確可靠，為基礎(chǔ)研究、臨床治療和藥物篩選提供針對人類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽超家族成員OATP-E方面研究的有效手段；初步應(yīng)用發(fā)現(xiàn)在對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中，OATP-EmRNA的表達(dá)量要比不耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MC