用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)RHDV、RHDV2的初步研究.pdf

1、兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）對(duì)養(yǎng)兔業(yè)來說是一種威脅很大的的烈性傳染性疾病，由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic diseasevirus，RHDV)引起，主要侵害2月齡以上的青壯年兔，造成的發(fā)病率和病死率都非常高，讓家兔養(yǎng)殖行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益大幅降低。從2010年開始，歐洲地區(qū)出現(xiàn)了兔出血癥病毒變異型，又稱兔出血癥病毒2型（Rabbit hemorrhagic disease

2、virus tape2，RHDV2），可造成30日齡以下幼兔和免疫兔瘟家兔的死亡，這一情況引起了養(yǎng)兔業(yè)的廣泛關(guān)注。鑒于兔出血癥病毒出現(xiàn)的變異情況及新的流行趨勢(shì)，本試驗(yàn)通過對(duì)比分析RHDV, RHDV2的結(jié)構(gòu)蛋白基因VP60，分別對(duì)RHDV,RHDV2的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，以期為RHD的快速檢測(cè)診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供科學(xué)技術(shù)工具。
　　根據(jù)NCBI上登錄的RHDV2 VP60基因序列設(shè)計(jì)

3、6對(duì)引物，人工合成靶基因。將靶基因純化回收，通過連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV2。根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物，以陽性質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，建立關(guān)于RHDV2的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法，并優(yōu)化反應(yīng)體系，進(jìn)行特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)。用建立的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室人工感染樣品（7份）和臨床采集樣品（15份）進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示建立的RHDV2檢測(cè)方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。該方法可

4、檢測(cè)的重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV2的最低拷貝數(shù)為68個(gè)拷貝，該方法只能特異性的擴(kuò)增RHDV2，對(duì)RHDV、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌、兔大腸桿菌和兔健康組織RNA的擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性，以陽性質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的Ct值組內(nèi)變異系數(shù)均小于0.8％，而該方法對(duì)RHDV人工感染樣品和15份臨床采集樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
　　通過比較分析NCBI上已登錄的兔出血癥病毒VP60基因序列，選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。提取RHDV陽性病料

5、總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出979bp大小的RHDV基因片段，并克隆到pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV。同時(shí)在擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并熒光定量PCR引物，目的片段大小為165bp，以pMD19-T-RHDV為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化和特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)，建立了RHDV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。再利用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方

6、法對(duì)RHDV人工感染家兔（7只）進(jìn)行檢測(cè)并分析各組織器官的病毒含量，同時(shí)參照文獻(xiàn)中的RT-PCR方法進(jìn)行平行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明建立的RHDV檢測(cè)方法最低可檢測(cè)的重組質(zhì)粒pMD19-T-RHDV的拷貝數(shù)為81個(gè)拷貝，靈敏度優(yōu)于RT-PCR方法。該方法只能特異性擴(kuò)增RHDV，pMD19-T-RHDV2、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌、兔大腸桿菌和兔健康組織RNA的擴(kuò)增均為陰性;以陽性質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的Ct值在組內(nèi)的變異系數(shù)均小于1.12％，說