一步法雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的一種鴨的急性、高度致死性傳染病，給我國乃至全世界的養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文針對(duì)1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)的VP0基因及3型鴨甲肝病毒(DHAV-3)的VP3基因分別設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了分別檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3的單一熒光定量RT-PCR方法及同時(shí)檢測(cè)DHAV-1和DHA

2、V-3的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法，主要結(jié)果如下:
　　1、熒光定量RT-PCR檢測(cè)DHAV-1
　　在DHAV-1 VP0區(qū)域設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，建立了一步法rRT-PCR檢測(cè)DHAV-1的方法。該法在底物(DHAV-1核酸)濃度為4.88×1010 copies/μL-4.88×101 copies/μL范圍內(nèi)相關(guān)方程為Y=-3.367X+42.688，R2=1.000，具有良好的線性關(guān)系;擴(kuò)增效率為98.1％

3、，對(duì)核酸的檢出低限為49copies/μL，該檢測(cè)方法對(duì)DHAV-3、鴨疫里默氏桿菌、鴨瘟、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、多殺巴氏桿菌、新城疫病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨腫頭出血癥病毒、雛鵝新型病毒性腸炎病毒等病原檢測(cè)為陰性，具有良好敏感性和特異性。
　　2、熒光定量RT-PCR檢測(cè)DHAV-3
　　在DHAV-3 VP3區(qū)域設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，建立一步法rRT-PCR檢測(cè)DHAV-3的方法。該方法在底物(DHA

4、V-3核酸)濃度為4.72×1010copies/μL-4.72×101 copies/μL范圍內(nèi)相關(guān)方程為Y=-3.373X+44.261， R2=0.996，具有良好的線性關(guān)系;擴(kuò)增效率為97.9％;對(duì)核酸的檢出低限為48copies/μL，該檢測(cè)方法對(duì)DHAV-1、鴨疫里默氏桿菌、鴨瘟、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、多殺巴氏桿菌、新城疫病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨腫頭出血癥病毒、雛鵝新型病毒性腸炎病毒等病原檢測(cè)為陰性，具有良好

5、敏感性和特異性。
　　3、一步法雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3方法的建立
　　在DHAV-1 VP0區(qū)域和DHAV-3 VP3區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，建立了一步法雙重rRT-PCR檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3的方法。該方法在底物(DHAV)濃度為1010-101 copies/μL數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。其中，DHAV-1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=-3.371X+42.679，R2=0.

6、999，擴(kuò)增效率為98.0％，靈敏度為49copies/μL，DHAV-3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=-3.398X+42.858，R2=0.998，擴(kuò)增效率為96.9％，靈敏度為5copies/μL。該方法僅對(duì)DHAV-1和DHAV-3呈檢測(cè)陽性，而對(duì)鴨疫里默氏桿菌、鴨瘟、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、多殺巴氏桿菌、新城疫病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨腫頭出血癥病毒、雛鵝新型病毒性腸炎病毒等病原檢測(cè)陰性，具有良好敏感性和特異性。
　　

7、4、DHAV-3單獨(dú)或與DHAV-1混合感染在鴨胚內(nèi)的增殖規(guī)律
　　應(yīng)用建立的一步法rRT-PCR方法對(duì)DHAV-3在鴨胚體內(nèi)增殖和分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明鴨胚在感染DHAV-3后24h各組織均檢出DHAV-3（含量為104-105 copies/g數(shù)量級(jí)），鴨胚死亡時(shí)間集中在接種DHAV-3后56-60，h，死亡鴨胚各組織病毒含量為107-109 copies/g數(shù)量級(jí)，其中尿囊膜含毒量最高為109.73, copies/g。

8、r>　　對(duì)采集自全國各地的38份疑似鴨肝炎肝臟病料進(jìn)行單一熒光定量RT-PCR檢測(cè)及雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)，二者檢測(cè)結(jié)果一致，其中27份為DHAV-1、7份為DHAV-3、4份為DHAV-1和DHAV-3混合感染。
　　對(duì)DHAV-1和DHAV-3混合感染鴨胚中DHAV-1和DHAV-3的增殖和分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明鴨胚各組織中DHAV-1與DHAV-3均在接種后60 h達(dá)到最大病毒含量，為108-1010 copies/g

9、數(shù)量級(jí);其中肌肉、心、肝、肌胃和腸DHAV-1含量最高達(dá)1010copies/g數(shù)量級(jí)，腦和尿囊液DHAV-1含量最高約為109 copies/g數(shù)量級(jí);腦、肌肉、心、肝、肌胃和腸DHAV-3含量最高為108-109 copies/g數(shù)量級(jí)，尿囊液DHAV-3含量最高達(dá)1010 copies/mL數(shù)量級(jí)。
　　對(duì)不同比例病毒量混合接種死亡鴨胚尿囊液及胚體進(jìn)行一步法雙重rRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)固定DHAV-1接種量為108 cop

10、ies時(shí)，隨著DHAV-3接種量的減少(108-104copies)，死亡鴨胚尿囊液中DHAV-3增殖拷貝數(shù)量級(jí)由108 copies/mL降至104copies/mL，胚體中DHAV-3含量由107 copies/g降至106 copies/g數(shù)量級(jí);當(dāng)DHAV-3接種量為108 copies，隨DHAV-1接種量的減少（108-104 copies），死亡鴨胚尿囊液中DHAV-1增殖量穩(wěn)定在108-109 copies/mL數(shù)量級(jí)，