16S rRNA等相關基因快速檢測幽門螺桿菌及其毒力的多重基因定量分析系統的建立與應用.pdf

1、目的：
　　1.設計針對H.pylori菌種特異性及其毒力相關基因位點的引物，建立H.pylori鑒定、毒力相關基因的25重體系的多重基因分析系統。
　　2.評估H.pylori多重基因分析系統檢測幽門螺桿菌的靈敏度和特異度。
　　3.利用H.pylori單拷貝基因ureC基因建立標準定量曲線，建立H.pylori定量分析系統。
　　方法：
　　1.建立H.pylori鑒定、毒力相關基因的25重體系的多重基

2、因分析系統
　　在NCBI數據庫獲取25種鑒定和毒力相關基因的原始序列，利用NCBI-Primer、Primer3.0、Premier Primer5.0三種引物設計工具針對每種基因設計多對引物。利用H.pylori標準菌株NCTC11637和悉尼SS1的DNA模版反復驗證所設計引物的有效性，同時不斷改變多重PCR的反應條件（主要是退火溫度），最后摸索出25對引物的最佳組合以及最佳反應條件，減少引物之間的競爭，抑制非特異擴增，最終

3、使每對引物都能夠有效表達。
　　2.評估多重基因分析系統靈敏度和特異度
　　構建載體，建立10倍濃度梯度，拷貝數分別為10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108，針對每個拷貝數看多重基因分析系統是否有目的擴增信號來評估其靈敏度。利用大腸埃希菌標準菌株ATCC25922、銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853、乙肝病毒標準質控品、水作為陰性模版作為陰性對照體系，引物為25對上述針對

4、H.pylori設計的引物，根據是否有擴增信號來評估該多重PCR系統的特異度。
　　3.利用H.pylori單拷貝基因ureC基因建立標準定量曲線，建立H.pylori定量分析系統。
　　構建載體，建立10倍濃度梯度，拷貝數分別為1、10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108，根據每個拷貝梯度所得出的目的峰面積，利用Curve expert統計軟件建立拷貝數與峰面積之間的函數關系

5、。
　　結果：
　　1.H.pylori鑒定、毒力相關基因的25重體系的多重基因分析系統的建立
　　通過對引物和反應條件的反復優(yōu)化，最終使4對重要的鑒定基因（16SrRNA、ureC、26KDa和ureA基因）的引物和21對毒力相關基因在同一反應體系中均得到有效表達。探索到最佳反應條件為:94℃預變性1min，94℃變性30s，60℃退火30s，70℃延伸1min，35個循環(huán)，最后70℃延伸1min。引物最適濃度:ur

6、eC基因的正向引物為200nmol/μL，反向引物為1μmol/μL;其余每對引物的濃度均為200nmol/μL。最佳模板濃度為10nmol～20nmol范圍之間。
　　2.多重基因分析系統靈敏度和特異度的評估
　　對各梯度的擴增結果顯示，該系統最少可以擴增出10拷貝的ureC基因，靈敏度很高;用大腸埃希菌標準菌株ATCC25922、銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853、乙肝病毒標準質控品、水作為陰性模版作為陰性對照體系時

7、，該多重基因分析系統并沒有出現任何擴增信號，表明系統高度特異。
　　3.通過建立H.pylori標準定量曲線建立定量分析系統
　　選取1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10梯度建立標準曲線。8個點對應的GeXP的曲線下面積分別為105032、62315、56476、47014、33849、23843、11106、7023。根據各梯度拷貝數和其所對應的GeXP曲線下面積來建立標

8、準定量曲線。所得標準曲線的相關系數r=0.99817222＞0.99，因此該標準定量曲線可以用來對H.pylori進行定量。
　　結論：
　　1.多重基因分析系統應用于H.pylori的檢測能同時檢測多個基因位點的表達，可以利用多基因來確證H.pylori的感染，同時根據多重毒力相關基因的表達情況可以預測H.pylori的致病性，具有重要臨床指導意義。
　　2.該多重基因分析系統具有快速、高靈敏度和高特異度的特點，還可