HBV基因分型生物傳感器基因芯片的制備及初步臨床研究.pdf

1、乙型肝炎仍是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重的危害人類的健康。全世界目前有超過3.5億人感染乙肝病毒，導(dǎo)致慢性乙型肝炎，肝硬化甚至肝癌，每年世界范圍內(nèi)因感染乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)導(dǎo)致的死亡和后遺癥人數(shù)達(dá)120萬人。中國、東南亞、非洲的50﹪的肝硬化和70﹪-90﹪肝癌是由HBV感染引起的。每年導(dǎo)致一百余萬人的死亡。我國在世界上屬于HBV感染的高發(fā)區(qū)，目前全國約有1.3億人是HBV攜帶者，慢性肝炎病人約2

2、300萬。 目前HBV分型有血清學(xué)分型與基因分型。血清型的區(qū)分只是根據(jù)乙肝表面抗原上的某幾個氨基酸的免疫活性來區(qū)分，通過對不同亞型的HBV DNA的全基因序列進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)血清型的區(qū)分僅是S基因區(qū)兩個核苷酸位點(diǎn)的差異，血清型的區(qū)別并不能真正反映HBV基因序列的異質(zhì)性。于是提出HBV基因分型的概念，即HBV基因分型的標(biāo)準(zhǔn)為，HBV基因組全序列測定，對比，如果基因序列異質(zhì)性≥8﹪，或者說同源性<92﹪，即可分為不同的基因型。由于

3、基因分型能真正反映病毒基因組的變異，并且有研究表明不同的HBV基因型導(dǎo)致的肝炎，其疾病的嚴(yán)重程度、并發(fā)癥的發(fā)生如肝硬化、肝細(xì)胞肝癌以及對治療的反應(yīng)性都有顯著不同，因此研究HBV基因分型及其方法有重要的意義。 本課題研究基于生物傳感器基因芯片技術(shù)平臺，通過設(shè)計引物和型特異性探針，構(gòu)造一種新的基因芯片，并對其敏感性與可靠性進(jìn)行檢測分析，它克服了傳統(tǒng)基因芯片需要激光掃描儀掃描觀察結(jié)果的缺點(diǎn)，使雜交信號可通過肉眼觀察，同時具有雜交信號有

4、或無的判讀、操作簡便、并且能檢測HBV的混合感染的特點(diǎn)。為HBV基因分型提供了一個很好的解決辦法。同時，通過對臨床標(biāo)本的檢測，為本地HBV基因型的分布提供一份參考資料。 材料和方法: 1．材料 1.1 研究標(biāo)本 110例中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院2006年1月-2007年1月住院病人，經(jīng)檢驗(yàn)科檢測乙肝病毒DNA陽性的血清(病毒量范圍為10<'3>-10<'7>/ml)。血清標(biāo)本收集后存于-80℃中備用。 1.2

5、 標(biāo)準(zhǔn)基因型質(zhì)粒 pBlue 991 E-Dimer T7，genotype A(Gen Bank：X 51970)[25]。pHTD，enotype B(GenBank：X98077)[26]。plasmid D1dimer,genotype C(GenBank：D16666)[27]。pSM2，genotype D，(GenBank：V01460)[28]。由Kirschberg教授惠贈[29]。 1.3 試劑和主要儀器主要

6、試劑： (1) 生物傳感基因芯片(購于珠海賽樂奇生物技術(shù)有限公司)； (2) 核酸提取液(杭州艾康生物技術(shù)有限公司)； (3) PCR相關(guān)試劑(10mm dNTP，10x PCR buffcr，25mm MgCl2，5U/ul Taq酶)購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司； (4) 瓊脂糖，分析純(購于北京索萊寶科技有限公司)； (5) 6x上樣緩沖液(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)； (6)

7、 DNA marker(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)； (7) 10mg/ml溴化乙錠(EB)(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)； (8) 連接酶(購于珠海賽樂奇生物技術(shù)有限公司)； (9) 純甘油、PBS (pH8.3)、NaOH、NaCl、檸檬酸鈉、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液、SDS、EDTA、KCI、Tris等化學(xué)試劑均為分析純，購于上海生工生物技術(shù)有限公司； (10) 所有用水均

8、為實(shí)驗(yàn)室自制的三蒸水。 (11) 引物和探針：PCR引物，P1探針，P2探針(3‘端連接生物素biotin)。(上海生工生物公司合成) 主要儀器：PCR擴(kuò)增儀： MJ Research PTC200；凝膠成像儀：Hema UV-紫外線分析凝膠成像儀 2．實(shí)驗(yàn)方法 2.1 通過NCBI等數(shù)據(jù)庫及多種生物信息學(xué)軟件分析HBV基因組序列，設(shè)計引物和型特異性分型探針。 2.2 芯片基片的準(zhǔn)備和HBV基因分型生物傳

9、感器基因芯片制備。 2.3 用裂解液，煮沸裂解法提取血清中HBV DNA作為模板。 2.4 PCR擴(kuò)增樣本，產(chǎn)生目標(biāo)序列。 2.5 PCR產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交。 2.5.1 比較不同的變性方法(熱變性法和堿變性法)使PCR產(chǎn)物變?yōu)閱捂湆﹄s交結(jié)果的影響，確定要使用的變性方法。 2.5.2 根據(jù)芯片雜交結(jié)果摸索最佳反應(yīng)時間，使雜交信號穩(wěn)定、明顯。 2.6 芯片檢測的特異性、重復(fù)性研究。

10、2.7 不同濃度的病毒DNA作為模板的檢測。 結(jié)果: 1．各分型探針設(shè)計合理，具有較高的特異性，陽性對照探針設(shè)計合理，包含了各基因型HBV。 2．各PCR引物能有效擴(kuò)增目標(biāo)片段。 3．熱變性法和堿變性法均能使目標(biāo)片段PCR產(chǎn)物變性為單鏈，通過對雜交結(jié)果的比較，認(rèn)為堿變性法處理后結(jié)果較清晰，因此選用堿變性法對雙鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性； 4．雜交時間以40分鐘時最佳。 5．HBV基因分型生物傳感

11、器基因芯片的雜交信號可通過肉眼觀察，陰陽信號可實(shí)現(xiàn)完全有或無的分辨。 6． (1)A、B、C、D 4型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過芯片檢測后結(jié)果準(zhǔn)確，說明該HBV基因分型芯片具有較高特異性。 (2)A~D型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒各模板的30次檢測中，結(jié)果均得到100﹪重復(fù)，而HBV陰性血清均未檢出，說明芯片檢測具有較好的重復(fù)性。 7．臨床標(biāo)本分型結(jié)果：共110例，其中99例明確分型，B型65例(59.1﹪)，C型34例(30.9﹪)

12、，11例未檢出。說明本次樣品的重復(fù)檢出率為90﹪。 8．不同濃度的病毒DNA作為模板，當(dāng)HBV病毒濃度≥104copies/ml時雜交信號為陽性，而<104copies/ml時雜交信號為陰性，因此提示當(dāng)血清HBV病毒濃度≥104copies/ml時可使用該方法進(jìn)行檢測。 結(jié)論: 1．本研究構(gòu)建的HBV基因型分型生物傳感器基因芯片具有可用肉眼分辯檢測結(jié)果、實(shí)現(xiàn)雜交陰陽信號有或無的分辨、操作簡便。 2．該芯片