蛋白激酶C-a對內(nèi)髓集合管上皮細胞系mIMCD3骨架actin的影響.pdf

1、目的：
　　 研究蛋白激酶C-α（PKC-α)對內(nèi)髓集合管上皮細胞系（mIMCD3）骨架actin的影響，初步探討PKC-α在集合管對尿液物質轉運的作用機制及意義。
　　 方法：
　　 常規(guī)體外培養(yǎng)mIMCD3細胞，提取四種不同的PKC-α基因的重組體，脂質體介導其轉染入mIMCD3細胞，用PKC-α基因的表達載體抗性基因藥物G418篩選后獲得穩(wěn)定轉染細胞，隨機分為①空質粒轉染組（K組）：轉染PKC-α基因空質粒

2、重組體的細胞②野生型轉染組（W組）：轉染PKC-α基因野生型質粒重組體的細胞③顯性激活型質粒轉染組（A組）：轉染PKC-α基因顯性激活型質粒重組體的細胞④顯性滅活型質粒轉染組（R組）：轉染PKC-α基因顯性滅活型質粒重組體的細胞。轉染后24h顯微鏡下觀察轉染細胞的熒光表達情況，評估轉染效率；轉染后72h細胞用含有G418藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并最終獲得穩(wěn)定表達PKC-α基因的細胞。Real-time 實時熒光定量PCR檢測上述各組穩(wěn)轉細胞的

3、PKC-α mRNA表達水平變化，western blot檢測各組穩(wěn)轉細胞中PKC-α蛋白表達及其活性，細胞免疫化學方法檢測各組穩(wěn)轉細胞骨架actin的結構變化。
　　
　　 結果
　　 ⑴ 成功獲取了穩(wěn)定表達不同PKC-α基因重組體的mIMCD3細胞系。⑵ 熒光顯微鏡下觀察轉染后24h細胞熒光表達情況，轉染效率平均為36±2％。⑶ Real-time 熒光定量PCR結果顯示：A組、W及R組 PKC-α mRN

4、A表達較K組明顯升高(p<0.05)，而A組、W及R組三組間比較，變化不明顯(p＞0.05)。Western blot結果顯示：A組、R組及W組PKC-α蛋白表達較K組明顯升高(p<0.05)，而W組、A組與R組三組間比較，沒有明顯差別(p＞0.05)；PKC-活性檢測顯示A組與其它三組比較活性明顯升高(p<0.05)，R組活性較其它組明顯下降(p<0.05)。⑷細胞免疫化學顯示：K組及W組主要分布在細胞頂膜周邊，兩組間沒有較大區(qū)別，而