內(nèi)毒素致腎集合管上皮細(xì)胞損傷與水通道蛋白2表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 內(nèi)毒素血癥是梗阻性黃疸時腎功能損害的重要的病理生理機(jī)制之一。之前本課題組通過研究大鼠梗阻性黃疸動物實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn),梗阻性黃疸時,腎集合管上皮細(xì)胞中AQP2的表達(dá)顯著降低。本實(shí)驗(yàn)擬在大鼠內(nèi)毒素血癥模型及細(xì)胞水平上明確內(nèi)毒素對大鼠腎集合管上皮細(xì)胞的作用,以及水通道蛋白2表達(dá)的變化。
　　 方法：
　　 選WISTAR大鼠用腹腔注射方法建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型,根據(jù)LPS的作用時間處死取腎髓質(zhì),用免疫熒光及We

2、stern Blot方法檢測AQP2表達(dá)。培養(yǎng)并傳代大鼠腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞系mlMCD-3,選取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞制作細(xì)胞爬片,免疫組化DAB染色法檢測水通道蛋白2在大鼠腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3的表達(dá)。分別用終濃度為0.1,0.5,1,5,10μg/L的內(nèi)毒素與大鼠腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3培養(yǎng)4h,8h,12h,24h后用CCK-8檢測吸光度,計(jì)算細(xì)胞抑制率。選取作用明顯的終濃度為10μg/L的內(nèi)毒素分別作用于mlMCD-3及AQ

3、P2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的mlMCD-3,在作用4h,8h,12h,24h后流式細(xì)胞儀檢測凋亡。所有計(jì)數(shù)資料均用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 免疫組化和DAB染色可見,細(xì)胞胞漿中大量棕紅色顆粒,呈片或呈堆積狀排列,證明mIMCD-3表達(dá)AQP2。
　　 LPS抑制腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3增殖。濃度低于5μg/L時,LPS的濃度變化對細(xì)胞

4、增殖的抑制作用差別不大,增大濃度梯度時,LPS對細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng),具有濃度依賴性。濃度為0.1μg/L的LPS在對細(xì)胞作用的早期,對細(xì)胞不僅沒有抑制,反而有增殖的作用。當(dāng)作用時間增加到24小時時,相鄰濃度組間的比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,各組間細(xì)胞的抑制率無差別。不同時間組分別行單因素方差比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。但0.1μg/L組4小時和8小時,0.5μg/L組4小時和8小時,8小時和12小時比較,1μg/L組4小時和8小

5、時比較,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。證明濃度低于1μg/L時,細(xì)胞的抑制率隨時間變化不大。濃度大于等于5μg/L時,任意兩兩組間對比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。LPS對mIMCD-3的抑制作用具有時間依賴性。
　　 LPS誘導(dǎo)腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3凋亡。將終濃度為10μg/L的LPS溶液作用于腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mlMCD-34h,8h,12h和24h后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果表明,LPS對mIMCD-3的抑制作用主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡

6、,隨作用時間的延長,細(xì)胞凋亡率增加。
　　 對腎髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD-3行組化染色可以看出,LPS作用于mIMCD-3后,AQP的表達(dá)下調(diào),細(xì)胞中棕黃色顆粒變稀疏,且顏色變淺。濃度為10μg/L的LPS作用細(xì)胞4小時,8小時,12小時和24小時的平均光密度分析,作用時間4小時和對照組比較,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,作用時間達(dá)到8小時后隨作用時間延長AQP2表達(dá)逐漸下調(diào)。證明在短時間內(nèi),時間小于4小時,LPS對AQP2表達(dá)的變化沒有影響

7、,但隨LPS作用時間的延長,AQP2的表達(dá)下降。
　　 結(jié)論：
　　 LPS可以造成腎髓質(zhì)的損傷。LPS可以早期導(dǎo)致大鼠腎髓質(zhì)AQP2表達(dá)下調(diào),并且作用強(qiáng)度隨時間延長而增加。LPS能夠抑制mIMCD-3增殖,具有時間依賴性和劑量依賴性。LPS對細(xì)胞增殖的抑制作用主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨作用時間延長,細(xì)胞凋亡率增加。AQP2高表達(dá)的細(xì)胞在LPS作用后凋亡率較正常細(xì)胞降低,AQP2的高表達(dá)可以抑制mIMCD-3的凋亡。