基于SIRT1受體的新型抑制劑的設(shè)計(jì)合成及初步抗腫瘤活性研究.pdf

1、背景
　　癌癥的發(fā)生主要是因?yàn)檎＜?xì)胞經(jīng)過化學(xué)因素、物理因素、環(huán)境因素等誘發(fā)后，使得正常細(xì)胞無法發(fā)揮其生理功能進(jìn)而癌變。到目前位置癌癥仍然是人類生存的頭號敵人，使癌癥的治療成為社會的廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)之一。而隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與人類生活水平的逐步提高，生活壓力也逐漸增大，尤其是女性的生活與工作壓力的增加導(dǎo)致各種婦科疾病的高發(fā)，乳腺癌也成為了中國女性最常見的癌癥，在我國乳腺癌發(fā)病率與增長速度高達(dá)全球的兩倍之多，尤以城市地區(qū)最為明顯。在對乳腺

2、癌的幾種主要治療方法中，化學(xué)療法已成為主要首選療法之一，盡管目前在對乳腺癌的治療中，化學(xué)療法已取得了諸多進(jìn)展，可是，目前這些抗癌藥物毒副作用大，選擇性差及耐藥，使乳腺癌治療不能達(dá)到預(yù)期療效。因而探尋新的毒副作用小，治療劑量低的藥物具有重要意義。
　　近幾年來，越來越多的研究表明，組蛋白的乙?；腿ヒ阴；坏菣C(jī)體調(diào)控多種病理生理過程的重要的途徑和方法，更重要的是，它在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中也起到了重要作用。組蛋白去乙?；福℉DAC

3、）通過對組蛋白的去乙?；饔?，進(jìn)而能夠調(diào)控染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄活化以及抑制細(xì)胞周期、細(xì)胞分化，調(diào)控細(xì)胞凋亡這一系列生物效應(yīng)。隨著對組蛋白去乙?；傅难芯坎粩嗌钊?，組蛋白去乙?；敢殉蔀樾碌闹委熌[瘤的靶點(diǎn)，而其抑制劑（HDACI）也被作為一種新型的抗腫瘤藥物而被眾多科學(xué)家所研究。研究證實(shí)，HDACI具有廣泛的抗腫瘤作用及良好的市場前景，如已被FDA批準(zhǔn)上市的用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤治療的伏立諾他（Zolinza）、羅米地辛（Istodax）以及用

4、于外周T細(xì)胞淋巴瘤治療貝利司他（Beleodaq）均屬于此類藥物。這些藥物所需的治療劑量低，耐受好，不良反應(yīng)少，從而備受關(guān)注。
　　然而，以SIRT1為靶標(biāo)的抗癌藥物還未有相關(guān)報(bào)道。因而，針對此靶標(biāo)，對具有腫瘤活性的組蛋白去乙?；敢种苿┻M(jìn)行篩選意義重大。
　　目的：
　　根據(jù)SIRT1受體的晶體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用分子對接等計(jì)算機(jī)虛擬篩選的方法，篩選出對SIRT1靶標(biāo)有很強(qiáng)的親和力小分子抑制劑；并通過體外細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)CCK8測

5、定增殖抑制抑制、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞測定細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了篩選出的小分子抑制劑能有效抑制乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲能力并誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡；同時通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明了小分子抑制劑可以特異性的抑制SIRT1蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，首次提出了以SIRT1為靶標(biāo)的抗癌藥物，具有重大的意義。
　　方法：
　　1)運(yùn)用分子對接等計(jì)算機(jī)虛擬篩選的方法，利用分子對接軟件Discovery Studio3.0、SYBY

6、L2.0，對小分子化合物庫的化合物分子，進(jìn)行分子對接打分，選出其中與SIRT1活性口袋匹配度最高的小分子化合物。
　　2)運(yùn)用CCK-8方法檢測小分子化合物A及陽性對照藥物EX527、尼克酰胺及Sirtnol處理MB-MDA231、KM3、K562、CASKI、A549、HELA細(xì)胞的增殖抑制影響，篩選出抑制效果最為明顯的細(xì)胞系。
　　3)運(yùn)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測小分子抑制劑對乳腺癌細(xì)胞的侵襲抑制作用。
　　

7、4)對經(jīng)過EX527、小分子抑制劑處理48小時后的MB-MDA-231細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙染，研究其對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　5)通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)研究小分子抑制劑對乳腺癌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)影響，以及對相關(guān)起誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的信號通路蛋白的表達(dá)情況的影響。
　　成果：
　　1)運(yùn)用分子對接等計(jì)算機(jī)虛擬篩選的方法，從Drug Bank和Chem下載小分子數(shù)據(jù)庫中篩選出與SIRT1活性口袋匹配度

8、最高的分子，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物932對SIRT1靶標(biāo)具有較強(qiáng)的親和力。
　　2)通過CCK8增殖抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑及陽性對照物對MB-MDA231細(xì)胞有明顯抑制效果，并且與三種陽性對照物質(zhì)相比，小分子抑制劑對MB-MDA231的抑制作用呈明顯的濃度與時間依賴關(guān)系。
　　3)通過TRANSWELL細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑與陽性對照物EX527相比具有明顯的抑制侵襲作用。
　　4)運(yùn)用Annexin V-FITC/P

9、I雙染，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測證明不同濃度的小分子抑制劑及陽性對照藥物對MB-MDA231細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，然而我們所篩選出的小分子抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)高于陽性對照物 EX527誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)小分子化合物A具有抑制MB-MDA231細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)的作用，并且對相關(guān)起誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的信號通路蛋白的表達(dá)，如c-myc也有一定影響。
　　結(jié)果表明：
　　本課題以計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)為理論基礎(chǔ)，通過