新型小分子SIRT1抑制劑的發(fā)現(xiàn)及JARID1B體外活性篩選平臺的建立.pdf

1、組蛋白氨基酸殘基通過磷酸化、SUMO化、乙?；?、泛素化、甲基化等修飾調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達或抑制，是表觀遺傳學調(diào)節(jié)基因表達的重要分支。
　　HDAC（histone deacetylase）和HAT（histone acetylase）同時調(diào)節(jié)組蛋白賴氨酸的乙?；潭龋{(diào)節(jié)下游基因表達。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HDACs可以分為三個家族：HDAC I家族、HDACII家族及Sirtuin（HDACIII）家族。與HDAC I家族、HDACII家

2、族的去乙?；覆煌琒irtuin家族以NAD為輔酶，參與到包括癌癥在內(nèi)的多種病理生理過程。人體中存在七個Sirtuin的同源蛋白SIRT1-7，其中 SIRT1作為一個長壽因子而備受重視，SIRT1同時存在于細胞核和細胞質(zhì)。SIRT1在細胞不同位置的定位使 SIRT1除了能特異性的去除組蛋白 H4K16、H1K26及 H3K9的乙?；稽c外，還可以對其他蛋白底物的賴氨酸去乙?；?，包括IR、p53、FOXO、IRS、PPARγ等。在癌癥

3、的發(fā)生發(fā)展方面，SIRT1主要通過調(diào)節(jié)p53進而調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，SIRT1的抑制劑被應(yīng)用于多種癌癥研究，如乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、肺癌等。這些實驗結(jié)果證明SIRT1扮演了致癌基因的角色，與癌細胞形成、多藥耐藥之間有重要聯(lián)系。
　　另外，組蛋白甲基化和去甲基化在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用，自從2004年報道首個組蛋白去甲基化酶KDM1A后，之后的幾年里相繼有更多的組蛋白去甲基化酶被鑒別報道出來。目前已

4、經(jīng)發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶可以分為兩種，一種是以 KDM1A為代表，底物為單雙甲基化的H3K4、H3K9，輔酶是FAD；一類以JARID1B為代表，輔酶是Fe（II）和α-酮戊二酸，可以去甲基化H3K4me1/2/3，進而參與一系列病理生理過程。JARID1家族是包含了ARID、PHD、JmjC等特征性結(jié)構(gòu)域，底物為單、雙、三甲基化的H3K4去甲基化酶家族，目前家族成員有四個，分別是JARID1A，JARID1B，JARID1C，JAIR

5、D1D。所有JARID1家族成員均可以在體內(nèi)及體外水平對 H3K4進行去甲基化。人JARID1B（PLU1，KDM5B）與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括胃癌、黑色素瘤、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等。
　　在我們之前的實驗過程中，我們合成了一系列新的1,4-雙哌嗪二硫代甲酸（1-取代(1,2,3-三唑)-4）-甲酯類化合物，并發(fā)現(xiàn)這個系列的化合物有一定的抑癌作用。為了尋找這個系列化合物可能的作用靶點，利用分子對接和相關(guān)生化檢驗，我

6、們發(fā)現(xiàn)這個系列的化合物可以和SIRT1蛋白形成復合物，可逆性抑制SIRT1活性。為了在細胞水平進一步進行驗證，我們選擇了SIRT1重組蛋白水平抑制活性最高的三氮唑小分子3a進行了進一步的實驗。結(jié)果顯示，三氮唑小分子3a可以在細胞水平抑制SIRT1的活性，上調(diào)SIRT1底物H4K16及p53（K382）的乙?；?。為了更深層次的研究三氮唑小分子3a抑制活性特異性，我們檢測了3a對SIRT2在細胞水平的作用，結(jié)果顯示三氮唑小分子3a可以同

7、時上調(diào)SIRT2的底物alpha-tubulin（K40）的乙酰化水平。所以，三氮唑類小分子3a是非選擇性SIRT1/2抑制劑。另外，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)三氮唑小分子3a在上調(diào)p53（K382）的乙酰化水平的同時還上調(diào)了總 p53的表達。我們對此現(xiàn)象進行了進一步研究，結(jié)果表明三氮唑小分子3a可以在蛋白水平穩(wěn)定p53，抑制p53蛋白的降解。鑒于p53及SIRT1在癌癥中的重要作用，本研究將為新的SIRT1小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及SIRT1和p53

8、相互作用的研究提供基礎(chǔ)。
　　此外，我們選取了組蛋白去甲基化酶JARID1B蛋白N端1—852位的蛋白截短體進行原核重組蛋白的質(zhì)粒 pET30a-JARID1B的構(gòu)建。質(zhì)粒pET30a-JARID1B構(gòu)建完成后，轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）菌株進行原核表達。在聯(lián)用甲醛脫氫酶的基礎(chǔ)上對表達的重組 JARID1B進行了活性篩選平臺的建立和優(yōu)化。JARID1B的活性篩選平臺將用于本課題組合成的新型小分子化合物進行篩選，對以后新型的JAR