MicroRNAs在乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷中的作用及壬酸香草醇酯的干預(yù)研究.pdf

1、第一章MicroRNAs在乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷中的作用
　　 研究背景：
　　 大量飲酒引起急性消化道疾病（如胃出血、胃潰瘍等）顯著增加，慢性酗酒則可致胃腸功能紊亂、慢性萎縮性胃炎等。乙醇對(duì)胃粘膜損傷機(jī)制非常復(fù)雜，除了直接的化學(xué)灼傷外，還涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死等。大量研究表明，乙醇可促進(jìn)胃粘膜合成分泌多種炎癥細(xì)胞因子和氧自由基，誘導(dǎo)胃粘膜細(xì)胞凋亡，但確切機(jī)制尚不清楚。
　　 MicroRNAs(miRNAs)從轉(zhuǎn)

2、錄后水平特異地調(diào)控靶基因的表達(dá)，其本身的表達(dá)調(diào)節(jié)涉及MAPK/TRBP等信號(hào)途徑。目前至少有30多個(gè)miRNAs被證明參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。
　　 本實(shí)驗(yàn)將利用乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷模型探討凋亡相關(guān)miRNAs表達(dá)水平的變化及其涉及的信號(hào)途徑，并利用乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡模型進(jìn)一步確證。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)一動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 SD大鼠隨機(jī)分成2組:(1)對(duì)照組，(2)乙醇組。乙醇組給予1ml60％

3、酸化乙醇灌胃，1小時(shí)后收集胃組織。Guth改良法計(jì)算胃粘膜潰瘍指數(shù)(UI）;硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)丙二醛(MDA)含量;分光光度法檢測(cè)過氧化氫酶(catalase)、超氧化物歧化酶(SOD)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的活性;ELISA法檢測(cè)TNF-α含量;TUNEL染色檢測(cè)胃上皮細(xì)胞凋亡;Real time PCR檢測(cè)TNF-α和miR145、miR21、miR181a、miR19a、miR17、 miR

4、200c的表達(dá);Western blot檢測(cè)TRBP、JNK/p-38/ERK表達(dá)及磷酸化水平。
　　 實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 培養(yǎng)人胃上皮細(xì)胞株GES-1，分別給予MG132（泛素蛋白酶體通路阻斷劑）、SP600125(JNK抑制劑)處理或分別轉(zhuǎn)染miR19a mimics、miR21 mimics、miR200c mimics、 miR145 inhibitor，再給予5％的乙醇孵育4小時(shí)，收集細(xì)胞分別檢測(cè)caspas

5、e-3的活性、TNF-α含量、細(xì)胞凋亡率（流式細(xì)胞法）、miR19a、miR21、miR200c、miR145的表達(dá)以及TRBP、JNK表達(dá)及磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷模型中:氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)均顯著增加，表現(xiàn)為胃組織TNF-α、MDA含量增加，SOD、catalase活性下降，伴隨細(xì)胞凋亡率上升和caspase-3活性上調(diào);抗凋亡miRNAs(miR19a、miR21、miR1

6、7)顯著下調(diào)而促凋亡的miRNA(miR145)則明顯上調(diào);JNK蛋白磷酸化水平顯著上升，TRBP水平下降，而p38MAPK和ERK蛋白磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。
　　 (2)乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞凋亡模型中:乙醇誘導(dǎo)的TRBP降解可被JNK或蛋白酶抑制劑取消;乙醇上調(diào)miRNA-145表達(dá)、下調(diào)miRNA-19a、miR21、miR17、miR181a表達(dá)作用可被JNK或蛋白酶抑制劑取消;乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和caspase-3

7、活性可被JNK或蛋白酶抑制劑或miR19a mimics、miR21 mimics、miR145 inhibitor減輕。
　　 結(jié)論：
　　 乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷涉及凋亡相關(guān)miRNAs表達(dá)異常及JNK/TRBP途徑。
　　 第二章壬酸香草醇酯對(duì)乙醇誘導(dǎo)胃粘膜損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　 研究背景：
　　 許多藥物通過作用于某些受體（如普魯苯辛阻斷M受體、甲氰咪胍阻斷H2受體）調(diào)節(jié)內(nèi)源性活性物質(zhì)釋

8、放或直接補(bǔ)充內(nèi)源性活性物質(zhì)（如前列腺素E）而治療胃腸道疾病。辣椒素敏感的感覺神經(jīng)廣泛分布于胃腸道，參與胃腸道功能調(diào)節(jié)。給予辣椒素能激活辣椒素受體(TRPV1)促進(jìn)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)釋放減輕消炎痛和乙醇等所致的胃粘膜損傷。但由于辣椒素的神經(jīng)毒作用和強(qiáng)烈的刺激性，其臨床應(yīng)用（如胃腸道疾病防治）受到限制。
　　 甜椒素是近年來在甜椒品種CH-19中發(fā)現(xiàn)的辣椒素酯類物質(zhì)，具有與辣椒素類似的藥理作用。由于甜椒素沒有刺激性，幾乎無

9、神經(jīng)毒性，因此有取代辣椒素的傾向，用于鎮(zhèn)痛、減肥、抗癌等。由于甜椒素來源壟斷，價(jià)格昂貴，且沒有單體，甜椒素的研究及應(yīng)用受到限制。
　　 壬酸香草醇酯是目前已合成的與甜椒素化學(xué)結(jié)構(gòu)最接近的甜椒素類似物，通常被稱為“合成甜椒素”。壬酸香草醇酯保留了天然甜椒素的某些特性如刺激性低，具有抗氧化作用等。但壬酸香草醇酯是否能激活TRVP1，促進(jìn)CGRP的釋放，目前尚未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)將利用乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃粘膜損傷模型探討壬酸香

10、草醇酯是否對(duì)胃粘膜損傷具有保護(hù)作用;壬酸香草醇酯對(duì)胃粘膜的作用是否與激活TRPV1有關(guān);CGRP是否參與介導(dǎo)了壬酸香草醇酯對(duì)胃粘膜的作用;壬酸香草醇酯對(duì)胃粘膜的作用是否與促進(jìn)CGRP釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)miRNAs有關(guān)。
　　 方法：
　　 健康雄性SD大鼠，體重230-250g，隨機(jī)分成7組。(1)對(duì)照組;(2)乙醇模型組;(3)低劑量壬酸香草醇酯(0.3mg/kg)+乙醇組;(4)高劑量壬酸香草醇酯(1mg/kg)+乙

11、醇組;(5) capsazepine+高劑量壬酸香草醇酯(1mg/kg)+乙醇組;(6)辣椒素(0.3mg/kg)+乙醇組(7) capsazepine+辣椒素+乙醇組;(8)壬酸香草醇酯或辣椒素溶媒+乙醇組。SD大鼠給予相應(yīng)藥物灌胃處理45分鐘后，再用1ml60％酸化酒精灌胃，1小時(shí)后收集胃組織。分別檢測(cè)UI，catalase、SOD和caspase-3活性，TNF-α和CGRP含量(ELISA和免疫組化法)，細(xì)胞凋亡率，miR19a

12、、miR21、miR17、miR145的表達(dá)以及TRBP、ERK/JNK表達(dá)及磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)壬酸香草醇酯能顯著減輕乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷和細(xì)胞凋亡，該作用可被辣椒素受體阻斷劑取消。
　　 (2)壬酸香草醇酯能降低胃組織TNF-α、MDA含量，上調(diào)SOD活性，該作用可被辣椒素受體阻斷劑取消。
　　 (3)壬酸香草醇酯能顯著促進(jìn)胃組織CGRP的釋放，該作用可被辣椒素受體阻斷劑取消。

13、r>　　 (4)壬酸香草醇酯能逆轉(zhuǎn)乙醇對(duì)miR19a、miR21、miR17、miR145的表達(dá)調(diào)節(jié)作用，該作用可被辣椒素受體阻斷劑取消。
　　 (5)壬酸香草醇酯能增加ERK磷酸化水平，降低JNK磷酸化水平，減輕乙醇誘導(dǎo)的TRBP降解，該作用可被辣椒素受體阻斷劑取消。
　　 結(jié)論：
　　 壬酸香草醇酯對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制涉及激活TRPV1，促進(jìn)CGRP釋放，進(jìn)而糾正凋亡相關(guān)miRNAs的

14、異常表達(dá)。
　　 第三章CGRP對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制
　　 研究背景：
　　 CGRP是辣椒素敏感感覺神經(jīng)的主要遞質(zhì)，廣泛分布于心血管系統(tǒng)，發(fā)揮重要的心血管保護(hù)效應(yīng)。CGRP參與了缺血、熱應(yīng)激、心臟起搏或藥物預(yù)處理所誘導(dǎo)的心臟保護(hù)作用，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老等作用。
　　 CGRP亦是重要的胃粘膜保護(hù)因子。辣椒素、壬酸香草醇酯對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用與促進(jìn)CGRP釋放密

15、切相關(guān)。除舒張血管增加胃腸道血流量外，CGRP對(duì)胃粘膜的保護(hù)還涉及抗凋亡、抗氧化、抗炎癥等作用，但詳細(xì)機(jī)制還有待闡明。
　　 CGRP能夠顯著抑制異丙腎上腺素上調(diào)心肌細(xì)胞miR-1和下調(diào)miR133的表達(dá)，減少ROS和抑制心肌細(xì)胞凋亡，但CGRP對(duì)胃粘膜細(xì)胞的保護(hù)作用是否涉及對(duì)有關(guān)凋亡相關(guān)miRNAs的表達(dá)，尚未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)將利用乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡模型探討:(1)外源性應(yīng)用CGRP能否抑制乙醇誘導(dǎo)的細(xì)

16、胞凋亡;(2) CGRP能否調(diào)節(jié)與凋亡相關(guān)miRNAs的表達(dá);(3) CGRP調(diào)節(jié)miRNAs表達(dá)涉及哪些信號(hào)途徑。
　　 方法：
　　 (1)探討CGRP抗乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞凋亡作用及對(duì)凋亡相關(guān)microRNAs的表達(dá)調(diào)節(jié)。培養(yǎng)的GES-1細(xì)胞，分別給予CGRP,CGRPS-37或PD98059處理，再給予5％的乙醇孵育4小時(shí)，收集細(xì)胞分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，miR19a、miR21、miR17和miR145表達(dá)，

17、TNF-α含量和caspase-3活性。
　　 (2)探討CGRP對(duì)miR19a、miR21和miR145表達(dá)調(diào)節(jié)的時(shí)效關(guān)系。GES-1細(xì)胞給予CGRP(10nM)處理0.5、2或6h后，收集細(xì)胞檢測(cè)上述miRNAs的表達(dá)水平。
　　 (3)探討ERK信號(hào)途徑和TRBP蛋白是否涉及CGRP對(duì)凋亡相關(guān)miRNAs的表達(dá)調(diào)節(jié)。GES-1細(xì)胞給予CGRP(10nM)處理0.5或2h，并用CGRP8-37或PD98059干預(yù)，收

18、集細(xì)胞檢測(cè)ERK、TRBP蛋白水平和磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1) CGRP能顯著抑制乙醇誘導(dǎo)TNF-α生成，降低GES-1細(xì)胞凋亡率和caspase-3的活性，該作用可被CGRP-8-37或PD98059取消。
　　 (2) CGRP可逆轉(zhuǎn)乙醇對(duì)miR19a、miR21、miR17和miR145的表達(dá)調(diào)節(jié)作用，該作用可被CGRP-8-37或PD98059取消。
　　 (3) GES-1細(xì)胞孵育

19、CGRP后，抗凋亡相關(guān)miRNAs(miR19a、miR17、miR21)表達(dá)上調(diào)，2h后達(dá)高峰，6h開始下降，促凋亡miR145表達(dá)下調(diào)，在所檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)范圍呈時(shí)間依賴性趨勢(shì)。
　　 (4) GES-1細(xì)胞孵育CGRP2h，ERK和TRBP蛋白水平顯著上調(diào)，且呈時(shí)間依賴性趨勢(shì)，該作用可被CGRP-8-37或PD98059取消。
　　 結(jié)論：
　　 CGRP具有抗乙醇誘導(dǎo)的胃粘膜細(xì)胞凋亡作用，其機(jī)制涉及激活ERK