尿液微量清蛋白檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　 1.建立一種簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)的以PVDF膜為載體的染料結(jié)合法(PVDF膜-染料結(jié)合法)測(cè)定尿液中的微量清蛋白。
　　 2.建立一種簡(jiǎn)單、快速的體積排阻高效液相色譜法(SE-HPLC)測(cè)定尿液中的微量清蛋白。
　　 方法:
　　 1.PVDF膜-染料結(jié)合法：于PVDF膜上先加甲醇，再加清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)尿液樣本，用考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色，脫色、干燥后膜上形成樣本斑點(diǎn)。用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行斑點(diǎn)密

2、度掃描，制作斑點(diǎn)密度-清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，再計(jì)算出待測(cè)尿樣本中清蛋白的濃度。
　　 2.SE-HPLC法：清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或尿液樣本200μL與0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)400μL漩渦混勻后，自動(dòng)進(jìn)樣20μL分析測(cè)定；色譜柱為分子篩Agilent Zorbax GF-250柱(250 mm×4.6 mm i.d，4 um)；流動(dòng)相：溶劑A為0.1％(v/v)甲酸水溶液，溶劑B為乙腈，溶劑A與溶劑B體積比為85

3、:15；流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm；用外標(biāo)法測(cè)定峰面積對(duì)尿液微量清蛋白進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.PVDF膜-染料結(jié)合法：批內(nèi)和批間CV分別為9.1％和10.0％(50 mg/L)、5.6％和9.6％(100 mg/L)及5.0％和7.4％(200 mg/L)。對(duì)63例待檢樣本進(jìn)行檢測(cè)，免疫速率散射比濁法和PVDF膜-染料結(jié)合法的檢測(cè)結(jié)果均值分別為179.30±187.0

4、1 mg/L和237.63±157.81mg/L，兩法有良好的相關(guān)性(r2=0.8552)，但PVDF膜-染料結(jié)合法結(jié)果高于免疫速率散射比濁法(P=0.000)。方法的檢測(cè)低限為15 mg/L，線性范圍可達(dá)600 mg/L。Hb、膽紅素、IgG對(duì)方法有正干擾。尿液pH值對(duì)結(jié)果無(wú)顯著性影響。用PVDF膜比用醋酸纖維素膜檢測(cè)尿中清蛋白有更高的靈敏度。
　　 2.SE-HPLC法：清蛋白保留時(shí)間約為1.73 min，批內(nèi)和批間CV分別

5、為3.98％和4.05％(20 mg/L)、3.55％和3.60％(200 mg/L)及4.65％和4.74％(2000 mg/L)，平均回收率為99.2％。SE-HPLC法與免疫速率散射比濁法比較，其檢測(cè)結(jié)果均值在正常清蛋白尿組分別為40.0±24.6 mg/L、8.4±4.3 mg/L(P=0.000；n=40)，在微量清蛋白尿組分別為260.2±138.8 mg/L、57.9±37.3 mg/L(P=0.000；n=30)，在蛋白

6、尿組分別為1127.9±622.1 mg/L、1212.7±696.3 mg/L(P=0.001；n=30)。前兩組SE-HPLC法檢測(cè)結(jié)果明顯高于免疫速率散射比濁法，而在蛋白尿組SE-HPLC法檢測(cè)結(jié)果比免疫速率散射比濁法低約7％。SE-HPLC法的檢測(cè)低限為2mg/L，2000 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好(r2=0.9969)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究建立了一種PVDF膜-染料結(jié)合法檢測(cè)尿液微量清蛋白濃度，該