尿液細(xì)胞外囊泡液壓透析分離方法建立用于前列腺癌miRNAs檢測和評價研究.pdf

1、前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是危害男性健康的惡性疾病，中國前列腺癌發(fā)病率呈上升趨勢。目前常用于前列腺癌輔助診斷的指標(biāo)為前列腺特異性抗體(Prostate-specific antigen，PSA)，由于缺少特異性，基于PSA的前列腺癌監(jiān)測和篩查被認(rèn)為有過度診治的風(fēng)險。為了更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者、減少不必要的前列腺活檢，新型的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物亟待被發(fā)現(xiàn)，其中細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles，E

2、Vs)的研究受到了廣泛的關(guān)注。
　　EVs是細(xì)胞釋放的用于細(xì)胞間信息傳遞的膜性囊泡，EVs攜帶有親代細(xì)胞特異性的核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)的含量變化可反映機體的生理病理狀態(tài)，因此EVs有作為腫瘤生物標(biāo)志物的潛力。
　　EVs可從血清/血漿、尿液、腦脊液、唾液、乳汁等體液中分離得到，尿液作為一種可無創(chuàng)、大樣本獲得的體液標(biāo)本，是泌尿系統(tǒng)疾病研究的理想標(biāo)本類型。目前對尿液細(xì)胞外囊泡(Urinary extracellul

3、ar vesicles，UEVs)的分離方法尚未統(tǒng)一，因此本研究利用新型的液壓透析(Hydrostatic filtration dialysis，HFD)法分離健康人尿液中的EVs，與經(jīng)典的超高速離心法(Ultracentrifugation，UC)對比分離UEVs的能力和微小RNA(micro RNA，miRNA)的檢出情況，隨后在前列腺癌、前列腺增生和健康對照者的UEVs中驗證已報道的與前列腺癌相關(guān)的miRNA，評價UEVs中候選

4、miRNA的診斷效能。
　　本研究主要分為以下兩個部分:
　　第一部分 液壓透析法和超高速離心法UEVs分離效果的對比研究
　　實驗?zāi)康模?br>　　證實新型HFD法的UEVs分離能力，探索HFD分離的UEVs(HFD-UEVs)是否適用于后續(xù)的miRNA研究，并與經(jīng)典的UC法進行比較。
　　實驗方法：
　　分別用HFD法和UC法分離健康志愿者的UEVs，通過透射電子顯微鏡、NanoSight納米顆粒跟蹤分

5、析儀、Bradford蛋白定量和蛋白印跡技術(shù)對比UEVs的形態(tài)、粒徑分布和特異標(biāo)志物的表達，評估HFD和UC法的分離效率，采用Nnaodrop2000、Agilent2100生物分析儀和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測RNA總量、RNA組分和miRNA水平，并以配對t檢驗作統(tǒng)計分析。
　　實驗結(jié)果

6、：
　　HFD法和UC法分離得到的UEVs有相似的形態(tài)和粒徑分布范圍，均表達EVs特異標(biāo)志物，蛋白濃度及RNA總量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在RNA組分和miRNA水平方面也有一致結(jié)果。
　　實驗結(jié)論：
　　HFD法可簡便地用于大樣本UEVs的分離，其分離效率與經(jīng)典的UC法相當(dāng)，且HFD-UEVs可適用于后續(xù)的miRNA研究。
　　第二部分 UEVs前列腺癌相關(guān)miRNAs的檢測及評價研究
　　實驗?zāi)康模?br>　

7、　檢測已報道的與前列腺癌相關(guān)的miRNA，篩選有作為診斷標(biāo)志物潛力候選miRNA，對比血清和尿液EVs miRNA表達水平，分析EVs miRNA作為前列腺癌標(biāo)志物的能力。
　　實驗方法：
　　從文獻中篩選已報道的與前列腺癌相關(guān)的miRNA，分離前列腺癌、前列腺增生、健康對照者UEVs和配對血清EVs，逐步檢測miRNA的表達水平，第一組檢測標(biāo)本由21例前列腺癌和14例前列腺增生患者組成，對差異有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNA繼續(xù)在

8、第二組標(biāo)本中檢測，根據(jù)數(shù)據(jù)類型以t檢驗、one way ANOVA、Welch's ANOVA統(tǒng)計miRNA表達水平的差異，以LSD、Games-Howell進行多重比較，繪制受試者工作曲線(Receiver operating characteristic curve，ROC)分析miRNA的診斷效能。
　　實驗結(jié)果：
　　初步檢測結(jié)果顯示miR-107、miR-375、miR-21、miR-27a和miR-574在各組中

9、差異無統(tǒng)計學(xué)意義，選取miR-145、miR-1290、miR-141和miR-572在后續(xù)驗證中檢測。在UEVs中，前列腺癌患者miR-145和miR-1290水平顯著高于前列腺增生患者和健康對照，在血清EVs中，miR-572、miR-1290、miR-141和miR-145在前列腺癌患者中均顯著高于前列腺增生患者，且在血清EVs中的表達水平顯著高于在UEVs中的表達水平。ROC曲線和曲線下面積(Area underROC curv

10、e，AUC)提示血清PSA聯(lián)合尿液EVs miR-145(AUC:0.863)或血清PSA血清EVs miR-145(AUC:0.895)均可提高血清PSA單獨檢測(AUC:0.805)的診斷效能，且UEVs miR-145在Gleason Score≥8的患者中表達水平顯著高于Gleason Score≤7的患者。
　　實驗結(jié)論：
　　miR-145在前列腺癌患者和前列腺增生患者的UEVs和血清EVs中均有差異表達，血清或