牛精子全蛋白制備方法的建立及鮮、凍精差異蛋白的檢測.pdf

1、本研究分析了冷凍保存對牛精子蛋白表達(dá)的影響，探索了牛精液冷凍損傷的分子機(jī)理，為提高牛及其它物種的精子冷凍效果提供參考。 通過對幾種不同的制備精子全蛋白的方法、不同染色方法及各個(gè)方法的重復(fù)性進(jìn)行比較，最終選擇Trizol法作為精子蛋白制備的方法。應(yīng)用固相pH梯度(Immobilized pHgradient，IPG)膠條和雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)，采用硝酸

2、銀染色法，利用Image Master<'TM> 2D Platinum軟件進(jìn)行圖譜分析。結(jié)果檢測出約1 600多個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子量基本分布在10～100KD，等電點(diǎn)約為pH4～9的區(qū)域內(nèi)。同時(shí)，對等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)和十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodiumdo-decylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)中出現(xiàn)的具

3、體問題進(jìn)行分析，初步建立了牛精子蛋白表達(dá)的二維電泳圖譜。 采用已經(jīng)建立的精子二維電泳方法，對牛新鮮精子和冷凍精子進(jìn)行分析。結(jié)果獲得了背景清晰、分辨率高、重復(fù)性好的鮮精和凍精蛋白的雙向凝膠電泳圖譜，鮮精和凍精蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為：1681個(gè)和1513個(gè)，其匹配率達(dá)59.6％和75.7％。凍精蛋白質(zhì)點(diǎn)有10.2％的缺失，兩組存在顯著性差異(p<0.05)。其中選取鮮精組和凍精組8個(gè)差異點(diǎn)，5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在凍精中表達(dá)下調(diào)，3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在凍精中表