深綠卷柏中雙黃酮提取、分析及其與牛血清作用機(jī)理研究.pdf

1、深綠卷柏，藥用卷柏屬植物，由于良好的治療效果，已引起許多領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。本文運(yùn)用多種譜學(xué)技術(shù)對(duì)深綠卷柏中的雙黃酮類化合物進(jìn)行了一系列具有原創(chuàng)性的研究工作并取得以下很有意義的研究成果。
　　 一、在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化深綠卷柏總黃酮超聲輔助提取的工藝參數(shù)，得到最佳工藝條件為：提取溫度65℃，乙醇濃度70％，提取時(shí)間50min。在此條件下，提取的總黃酮含量為4.4mg/g，提取率為7.7％。以IC50值(半數(shù)抑制濃

2、度)為次參考指標(biāo)，得出了不同提取條件下提取得到的深綠卷柏粗提物抗氧化活性數(shù)據(jù)。在最優(yōu)工藝條件下，IC50值范圍在20.22-46.64mg/mL之間。
　　 二、以天然藥物化學(xué)為基礎(chǔ)，運(yùn)用化學(xué)及物理分離分析方法對(duì)深綠卷柏全草的乙醇提取物進(jìn)行分離、純化，得到穗花杉雙黃酮和橡膠樹雙黃酮2個(gè)雙黃酮單體化合物以及正十八烷酸、β-谷甾醇、豆甾醇等3個(gè)單體化合物。通過核磁共振、質(zhì)譜等光譜學(xué)技術(shù)確定了這些單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 三、運(yùn)

3、用GC-MS、HPLC-MS等現(xiàn)代的色譜技術(shù)，分析深綠卷柏中的各化學(xué)成分。從深綠卷柏中分析鑒定了59種化學(xué)成分。其中包括n-octacosane、9-octyl-hexacosane、3-phenyl-2-butanol等42種揮發(fā)性成分以及17種雙黃酮化合物。穗花杉雙黃酮、橡膠樹雙黃酮為深綠卷柏主要成分。采用反向HPLC法建立了同時(shí)測(cè)定穗花杉雙黃酮和橡膠樹雙黃酮的檢測(cè)方法?；厥章蚀笥?5％。結(jié)果表明：所建立的檢測(cè)方法適用于評(píng)價(jià)深綠卷柏

4、藥材的品質(zhì)。采用HPLC法建立了深綠卷柏藥材的指紋圖譜檢測(cè)方法，確定活性組分的分布及活性化合物的位置。依據(jù)此分離體系，考察了廣西五個(gè)不同產(chǎn)地，15個(gè)樣品的液相色譜圖，得到深綠卷柏的參照液相指紋圖譜。運(yùn)用中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件對(duì)這些色譜峰進(jìn)行評(píng)價(jià)，表明色譜圖間的相關(guān)系數(shù)大于0.9。色譜圖中有14個(gè)共有峰，可以確認(rèn)為深綠卷柏的特征指紋峰。
　　 四、采用負(fù)離子檢測(cè)模式下的電噴霧多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS)方法對(duì)穗花杉雙黃酮和羅伯

5、斯特雙黃酮的質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行了研究，討論了C3'-C8"與C3'-C6"連接的雙黃酮化合物結(jié)構(gòu)特征與質(zhì)譜裂解行為之間的異同。對(duì)卷柏屬植物中其他不同連接方式的雙黃酮化合物的裂解規(guī)律進(jìn)行總結(jié)，得到規(guī)律性的認(rèn)識(shí)：
　　 (1)雙黃酮化合物在相同的質(zhì)譜條件下可以在C環(huán)發(fā)生0，4健斷裂，生成m/z=375的碎片離子。對(duì)于C-O-C連接的雙黃酮化合物，C-O健易發(fā)生均衡碎裂，質(zhì)譜圖中產(chǎn)生較強(qiáng)的m/z=271的碎片離子峰。這些離子峰為雙黃酮化

6、合物的特征離子峰。
　　 (2)空間結(jié)構(gòu)對(duì)雙黃酮的裂解途徑有重要影響。與C3’-C8”相比C3'-C6"和C2'-C8"連接的雙黃酮更易于在離子碎片中脫去水分子出現(xiàn)環(huán)化的過程，生成豐度響應(yīng)值較高的碎片離子m/z=519、m/z=309以及m/z=401；C3'-C3"'連接模式則是在離子碎片中形成內(nèi)酯而出現(xiàn)環(huán)化的過程，產(chǎn)生m/z=371的碎片。C-O-C連接的雙黃酮化合物中，C-O健出現(xiàn)非均衡碎裂產(chǎn)生較強(qiáng)m/z=285的碎片離子

7、峰。此離子碎片中存在鄰位酚羥基，更易于進(jìn)一步碎裂而產(chǎn)生m/z為133、199、257等碎片離子。此規(guī)律可有效用于深綠卷柏中雙黃酮化合物的定性鑒別，共鑒定出的17個(gè)雙黃酮化合物。
　　 五、選取深綠卷柏中有代表性的芹菜素、穗花杉雙黃酮、橡膠樹雙黃酮三個(gè)化合物分別與牛血清白蛋白作用。系統(tǒng)探索了在不同溫度及濃度的條件下它們之間的作用機(jī)理，指出：
　　 (1)芹菜素與穗花杉雙黃酮的猝滅率與濃度都遵循Stern-Volmer方程以

8、及雙對(duì)數(shù)曲線方程。但是，芹菜素對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅，穗花杉雙黃酮對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅是動(dòng)態(tài)猝滅。
　　 (2)藥物分子的結(jié)構(gòu)對(duì)其與血清的結(jié)合有重要影響。
　　 A：穗花杉雙黃酮與牛血清白蛋白之間的結(jié)合力比芹菜素強(qiáng)3-20倍，比橡膠樹雙黃酮強(qiáng)8-10倍。說明在黃酮與血清的結(jié)合過程中，羥基扮演了非常重要的作用。芹菜素與牛血清白蛋白氨基酸殘基的結(jié)合距離最小，橡膠樹雙黃酮最大。說明在與牛血清作用的過程中，結(jié)合距