逼尿肌細胞、ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生及調控機制的研究.pdf

1、背景及目的： 本研究擬以細胞鈣瞬變?yōu)橛^察指標，比較分析ICCs細胞和平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變的特征及發(fā)生機制；并以反映平滑肌細胞內鈣釋放的STOCs和鈣火花(Ca2+ spark)為觀察指標，通過利用FKBP12.6基因敲除小鼠，對cADPR調節(jié)平滑肌細胞內質網中鈣釋放的機制進行探討。本研究將有助于我們深入對平滑肌細胞和ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變特征、發(fā)生和調控的認識，并為闡明膀胱ICCs細胞的功能提供初步的研究證據。本研究擬從以下

2、四個方面展開： 第一：利用免疫熒光單染及雙染的方法，觀察ICCs細胞在逼尿肌組織中的分布及與平滑肌細胞的關系，為后續(xù)平滑肌細胞和ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變的檢測提供參考； 第二：對膀胱逼尿肌組織鋪片中的平滑肌細胞和相鄰ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變進行檢測，比較分析兩種細胞自發(fā)性鈣瞬變的頻率和幅度，初步探討平滑肌相鄰ICCs細胞可能的功能； 第三：檢測細胞外鈣內流及細胞鈣庫中鈣釋放干預因素對細胞自發(fā)性鈣瞬變的影響，探討細

3、胞外鈣內流及細胞內質網中鈣釋放入胞漿在兩種細胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生的作用； 第四：對比野生型和FKBP12.6基因敲除小鼠中cADPR對膀胱平滑肌細胞STOCs、鈣火花及細胞內質網總鈣含量的影響，探討cADPR調節(jié)平滑肌細胞內質網中鈣釋放這-cADPR調控細胞鈣瞬變發(fā)生關鍵環(huán)節(jié)的機制，為深入了解cADPR調控平滑肌細胞鈣瞬變的機制提供實驗依據。 方法：本研究采用2-3月齡SD大鼠為研究對象。首先利用免疫熒光方法檢測逼尿肌組織

4、中ICCs細胞的分布及其與平滑肌細胞的關系。隨后參照Hashitani等[18]的方法制作膀胱組織鋪片，于記錄Chamber底部Physiological saline生理液灌流保持肌條鋪片活性。待肌條自發(fā)性收縮活動出現后，Fluo-4 AM負載肌條鋪片，激光共聚焦顯微鏡觀察鋪片中平滑肌細胞和ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變，隨后分別觀察L型、T型鈣離子通道阻斷劑Nimodipine、Nicl2，內質網IP3受體拮抗劑2-aminoethoxy

5、 diphenylborate(2-APB)，內質網ayR受體拮抗劑Ryanodine，內質網RyR受體激動劑Caffeine，內質網鈣泵抑制劑Thapsigargin及無鈣、高鈣生理液對平滑肌細胞和ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變的影響，探討平滑肌細胞和ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變產生、調控的機制。 最后利用FKBP12.6基因敲除小鼠探討cADPR調節(jié)膀胱平滑肌細胞內質網中鈣釋放的機制。通過PCR方法對敲除小鼠的基因表型進行鑒定。通過膜

6、片鉗記錄cADPR對平滑肌細胞自發(fā)性瞬時外向電流(spontaneous transient out currents，STOCs)的影響，使用膜片鉗和激光共聚焦顯微鏡共記錄的方法，同步觀察cADPR對平滑肌細胞STOCs和鈣火花(Ca2+ spark)的影響。利用激光共聚焦顯微鏡觀察cADPR對膀胱平滑肌細胞細胞鈣火花特征的影響，并通過Thapsigargin預處理了解內質網鈣泵是否參與cADPR調節(jié)平滑肌細胞中鈣釋放作用。利用Wes

7、tern blot實驗，檢測cADPR作用后，FKBP12.6從RyR2上釋放入胞漿的情況。利用雙Puff系統(tǒng)，通過瞬時使用10mM Caffeine，探討cADPR對平滑肌細胞內質網中總鈣含量的影響。 結果： 1.SD大鼠膀胱逼尿肌組織中存在ICCs細胞，ICCs細胞在逼尿肌肌束旁、肌束間和肌束內均有分布；ICCs細胞與平滑肌細胞、神經末梢在空間結構上緊密相鄰：肌束旁和肌束間的ICCs細胞有時可連成一片，有可能成為相鄰

8、肌束之間聯(lián)系的“橋梁”； 2.逼尿肌組織鋪片中平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變的特征如下： (1)逼尿肌組織鋪片Fluo-4剛負載完成時，平滑肌束中平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變多不同步；熱的生理液灌流20-30min后，平滑肌束中平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變趨于同步； (2)平滑肌細胞鈣瞬變多起源于肌束邊緣，而后傳遞到肌束的另一側；部分鈣瞬變可起源于肌束中部，而后向肌束兩側傳遞； (3)平滑肌細胞鈣瞬變在肌束內縱向傳遞幾乎無時

9、間延遲，但其在肌束內橫向傳遞有一定的時間延遲； (4)觀察到相鄰的肌束間可通過肌束間細胞進行鈣瞬變的傳遞。 3.成功同時記錄到膀胱逼尿肌組織鋪片中平滑肌細胞和肌束旁ICCs細胞的自發(fā)性鈣瞬變，平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變頻率相對較快，而肌束旁ICCs細胞的自發(fā)性鈣瞬變頻率相對較慢； 4.膀胱逼尿肌組織鋪片中的藥理實驗研究發(fā)現： (1)L型鈣離子通道阻斷劑Nimodipine能完全抑制平滑肌細胞的自發(fā)性鈣瞬變，但

10、對ICCs細胞的自發(fā)性鈣瞬變無顯著影響；T型鈣離子通道阻斷劑Nicl2可明顯降低平滑肌細胞的自發(fā)性鈣瞬變的頻率，對平滑肌細胞鈣瞬變的幅度及ICCs細胞的自發(fā)性鈣瞬變無明顯影響； (2)Ryanodine，Caffeine，2-APB，和Thapsigargin均可對平滑肌細胞的自發(fā)性鈣瞬變產生顯著的抑制作用，但不能完全消除平滑肌細胞的自發(fā)性鈣瞬變的發(fā)生； (3)Ryanodine，Caffeine，2-APB，和Thap

11、sigargin及無鈣生理液均可完全抑制ICCs細胞的自發(fā)性鈣瞬變，高鈣生理液可顯著增加ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變的頻率而降低其頻率。 5.成功對FKBP12.6基因敲除小鼠進行了基因表型鑒定。經鑒定，基因敲除小鼠繁殖后，表現為三種基因表型：純合子(FKBP12.6-/-)、雜合子(FKBP12.6+/-)和野生型(FKBP12.6+/+)； 6.cADPR可顯著增大野生型小鼠膀胱平滑肌細胞的STOCs，對FKBP12.6

12、基因敲除小鼠(純和子)平滑肌細胞STOCs卻無明顯影響； 7.膜片鉗和激光共聚焦顯微鏡共記錄的研究結果發(fā)現，cADPR可顯著增強野生型小鼠膀胱平滑肌細胞的STOCs及鈣火花，但對FKBP12.6基因敲除小鼠平滑肌細胞STOCs及鈣火花卻無明顯影響； 8.cADPR對野生型小鼠膀胱平滑肌細胞鈣火花有顯著影響，而對FKBP12.6基因敲除小鼠平滑肌細胞鈣火花卻無明顯調節(jié)作用。具體表現為：cADPR可顯著提高野生型小鼠膀胱平滑

13、肌細胞鈣火花的頻率、幅度及FWHM距離，明顯延長其上升時間和半數衰減時間：而cADPR對FKBP12.6基因敲除小鼠細胞鈣火花的上述特征性指標無明顯影響； 9.內質網鈣泵抑制劑Thapsigargin對cADPR調節(jié)平滑肌細胞自發(fā)性鈣釋放的作用無明顯影響； 10.Western blot實驗證實，cADPR可使FKBP12.6從RyR2上脫落下來，釋放入胞漿中； 11.cADPR可顯著降低野生型小鼠膀胱平滑肌細胞

14、內質網中的總鈣含量，而對FKBP12.6基因敲除小鼠內質網中的總鈣含量卻無明顯影響。 結論： 1.膀胱平滑肌自發(fā)性鈣瞬變在肌束中縱向傳遞和橫向傳遞的延遲不同可能來自傳遞機制的不同，而肌束間鈣瞬變的傳遞增強可能參與DI的發(fā)生； 2.熱生理液灌流使肌束中平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變趨于同步及鈣瞬變多起源于肌束邊緣提示：膀胱逼尿肌組織中存在起搏細胞的可能性很大，可能是膀胱起搏細胞的是：①肌束一側的平滑肌細胞和②肌束旁或肌束內

15、ICCs細胞；鈣瞬變也可起源于肌束中部，提示不同部位的膀胱平滑肌組織起搏細胞的分布可能存在差異； 3.膀胱組織鋪片中平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變頻率明顯快于肌束旁ICCs細胞，提示平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變起源于肌束旁ICCs細胞的可能性不大；考慮到目前肌束內ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變尚不能進行檢測，及目前技術手段對ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變觀察的限制，不排除肌束內和具有不同功能的肌束旁ICCs細胞是膀胱起搏細胞的可能性； 4.細胞外

16、鈣通過L型鈣離子通道入胞在平滑肌細胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生中起主要作用，而細胞內鈣庫中的鈣釋放入胞漿可能起輔助作用；Ca2+通過T型鈣離子通道入胞則可影響細胞自發(fā)性鈣瞬變的發(fā)生頻率； 5.細胞外鈣通過非L型鈣離子通道入胞及胞內鈣庫中的鈣釋放均參與ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變的發(fā)生；參與ICCs細胞自發(fā)性鈣瞬變發(fā)生的細胞膜上的非L型鈣離子通道可能是①鈉鈣交換體NCX、②T型鈣離子通道和③TRP(瞬時受體勢)離子通道中的多個通道： 6