人逼尿肌細胞β-腎上腺素能受體單一基因亞型細胞克隆的構(gòu)建.pdf

1、膀胱逼尿肌活動亢進是下尿路癥狀的常見原因，臨床上表現(xiàn)為尿頻、尿急和急迫性尿失禁，是膀胱儲尿功能障礙的表現(xiàn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，β腎上腺素能受體(β-adrenoceptor，β-AR)亞型能夠介導(dǎo)膀胱平滑肌松弛，對維持儲尿過程中膀胱良好的順應(yīng)性起著關(guān)鍵作用。但究竟哪一種β-AR亞型介導(dǎo)逼尿肌松弛，國內(nèi)外學(xué)者還有一定的爭論。為進一步探討β-AR亞型在逼尿肌中功能奠定基礎(chǔ)，我們擬采用反義基因(antisense)技術(shù)，構(gòu)建β-AR亞型的iRNA干

2、涉分子，封閉三種β-AR中的任意兩個，得到表達單一亞型的細胞克隆，再進一步進行研究，以確定β-AR激活對逼尿肌細胞的松弛和增殖的影響，并為尋找新的最終解決膀胱逼尿肌活動亢進的治療方法提供理論依據(jù)。 第一部分 膀胱平滑肌細胞的培養(yǎng)和鑒定 建立膀胱平滑肌細胞的培養(yǎng)方法、獲得大量具有正常生物學(xué)特性的細胞是深入研究細胞生物學(xué)特性和構(gòu)建組織工程膀胱的必要條件。近年來，F(xiàn)-H.Ma等對人膀胱平滑肌細胞進行了體外培養(yǎng)，并對β腎上腺素能

3、受體分布進行了初步的研究，但沒有對平滑肌細胞中β腎上腺素能受體生物學(xué)特性進行描述。為了更進一步深入研究人膀胱平滑肌細胞中β腎上腺素能受體的生物學(xué)機制，本研究進行了體外人膀胱平滑肌細胞培養(yǎng)，并進行形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性觀察。我們采用膠原酶消化法自標本分離出膀胱平滑肌細胞進行培養(yǎng)并予鑒定，現(xiàn)報告如下。1實驗材料 本研究應(yīng)用正常膀胱平滑肌組織作為研究材料，標本來源于住院膀胱平滑肌組織三塊均為膀胱癌行膀胱全切術(shù)患者，其患者經(jīng)術(shù)前經(jīng)尿動力學(xué)檢查證

4、實沒有逼尿肌功能障礙。 實驗結(jié)果 原代培養(yǎng)24小時時均可見平滑肌細胞貼壁生長，此后進入對數(shù)生長期，細胞傳代培養(yǎng)順利，將膀胱平滑肌細胞移至新的培養(yǎng)皿后7左右又可長滿整個培養(yǎng)皿底部，最長傳代至第五代，倒置顯微鏡下培養(yǎng)的平滑肌細胞均呈長梭狀集結(jié)于培養(yǎng)皿上形成典型的峰和谷樣構(gòu)形。免疫組化染色示傳代培養(yǎng)的膀胱平滑肌細胞α-actin染色均呈陽性。 討論： 國內(nèi)外學(xué)者對平滑肌細胞的研究主要集中于呼吸及心血管系統(tǒng)，

5、對尿路平滑肌細胞的研究較少。1993年，Baskin等培養(yǎng)了人和胎牛的膀胱平滑肌細胞并就其膠原分泌特性進行研究，以探討平滑肌組織在下尿路慢性梗阻情況下的病理生理改變。與傳統(tǒng)的膀胱平滑肌游離肌條或器官水平的研究相比，培養(yǎng)的平滑肌細胞有以下優(yōu)點：(1)成分純凈，避免了游離肌條中其他成分影響平滑肌細胞生理及藥理特性的顯示；(2)可以進行細胞內(nèi)機制研究；(3)可自少量平滑肌組織中獲取大量細胞用于實驗，并能建立細胞庫以備反復(fù)使用。對于人和豬體外培

6、養(yǎng)的膀胱逼尿肌細胞的電生理特性，Sui等的研究顯示：與剛分離出的膀胱平滑肌細胞相比，培養(yǎng)的平滑肌細胞膜通道密度有一定程度的下降，膜電位絕對值及膜電阻稍降低；培養(yǎng)的平滑肌細胞去極化速度減慢，培養(yǎng)的人平滑肌細胞去極化速度無明顯改變。他們認為膀胱逼尿肌細胞經(jīng)培養(yǎng)，傳代仍基本保持了原有電生理特性，對體外培養(yǎng)的逼尿肌細胞的研究結(jié)果可較好地反映體內(nèi)情況。尿路平滑肌細胞的獲取方法主要有兩種：酶消化法和組織植塊法。后者通過將平滑肌組織剪成2mm×2 m

7、m×3 mm組織塊并貼于培養(yǎng)皿上，細胞自組織塊向外遷移增殖。血管平滑肌細胞的培養(yǎng)也多用這兩種方法。組織植塊法并非每一組織塊均能萌出細胞，原代培養(yǎng)需2周左右；但一般認為，此法丟失的細胞少，適于組織較少時使用。酶消化法可在較短時間內(nèi)獲得大量細胞，原代培養(yǎng)時間明顯縮短，我們的原代培養(yǎng)僅需7～8天。本組最小組織塊僅2 mm×3mm×4 mm，亦獲得了足量的細胞用于原代培養(yǎng)，因此我們認為酶消化法也可以用于小組織塊的細胞分離。酶消化分離細胞時必須注

8、意：(1)組織塊應(yīng)盡量剪碎以利消化；(2)嚴格控制膠原酶濃度和消化時間，見消化液混濁、組織塊呈絮狀，或在顯微鏡下見消化液中有較多單個細胞或細胞小團塊時應(yīng)終止消化。酶消化法適合人膀胱平滑肌細胞的原代培養(yǎng)，并且0.1％Ⅱ型膠原酶的消化效果優(yōu)于其他濃度，同時無血清的199液體配制Ⅱ型膠原酶的效果也優(yōu)于無Ca<'2+>、Mg<'2+>的DHank's液配制Ⅱ型膠原酶。 平滑肌細胞的鑒定主要依靠細胞形態(tài)及α-actin檢測，在倒置顯微

9、鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)。α-actin在泌尿系組織中僅表達于平滑肌細胞，成纖維細胞、移行上皮細胞均無表達。本組中，培養(yǎng)的膀胱平滑肌細胞形態(tài)典型，α-actin免疫組化染色陽性，可以確定是尿路平滑肌細胞。獲取大量尿路平滑肌細胞是泌尿系器官組織工程學(xué)研究的必要條件。本實驗中，來自膀胱的平滑肌細胞擴增迅速，并順利傳代至第5代。傳代時均按1:4比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，傳代6次后細胞數(shù)量可達到原代細胞數(shù)量的46(4096)倍。因此，該培養(yǎng)方法