梗阻性DO逼尿肌細(xì)胞興奮性變化及其離子通道機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：逼尿肌過度活動(dòng)(DO)是一種常見的膀胱功能障礙，可以引起尿急、尿頻甚至急迫性尿失禁等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響了患者的正常生活和身心健康，同時(shí)也日益成為社會(huì)公共醫(yī)療系統(tǒng)的沉重負(fù)擔(dān)。正常膀胱在儲(chǔ)尿期處于一種“安靜”的狀態(tài)，并且由于良好的順應(yīng)性，在一定容量范圍內(nèi)都保持很低的腔內(nèi)壓，這有利于尿液從上尿路的輸送以及避免尿液的膀胱一輸尿管反流。這個(gè)過程是下尿路器官在一系列復(fù)雜的神經(jīng)、體液、心理意識(shí)以及自身等因素的調(diào)控下完成的協(xié)調(diào)過程。一旦由于

2、某種原因，此種和諧遭到破壞，膀胱出現(xiàn)了不受意識(shí)控制的收縮，就會(huì)出現(xiàn)上述的臨床表現(xiàn)，這些癥候群被統(tǒng)稱為膀胱過度活動(dòng)癥(overactive bladder，OAB)，而這種自發(fā)性膀胱收縮則被稱為逼尿肌過度活動(dòng)(DO)并可以被臨床尿動(dòng)力學(xué)檢查所記錄和診斷。DO在西方國(guó)家發(fā)病率很高，被列為10種最常見的慢性疾病之一；國(guó)內(nèi)雖然沒有大規(guī)模的臨床流行病學(xué)報(bào)告確切的發(fā)病率，然而就泌尿臨床診治情況來看，屬于非常常見的疾病。DO目前尚無理想的治療方法，最

3、常用抗膽堿能藥物進(jìn)行治療，但由于副作用過大，療效有限，患者的治療依從性非常差。因此，迫切需要尋找新的有效的替代療法。 關(guān)于DO的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究。綜合來看，原因復(fù)雜，可能系多因素參與致病，不同病因?qū)е碌腄O可能有不同的發(fā)病機(jī)理，但確切的發(fā)病機(jī)制還遠(yuǎn)未明了。目前，主要學(xué)說可歸納成神經(jīng)源性和肌源性兩種。按照ICS的分類，DO可分成特發(fā)性(idiopathic detrusor overactivity)和神經(jīng)源性(n

4、eurogenic detrusoroveractivity)兩種。具有相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)系統(tǒng)病變者稱為神經(jīng)源性，其余歸為特發(fā)性，而后者最常繼發(fā)于BOO性疾病，其中以BPH最為多見。盡管DO可能是多因素疾病，但目前已有大量證據(jù)表明，繼發(fā)于梗阻后的膀胱逼尿肌本身結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)贐OO所致DO的發(fā)生中占有極為重要的地位，即“肌源性”機(jī)理。針對(duì)不同病因所致DO可能具有不同發(fā)病機(jī)理這一特點(diǎn)，并且考慮到BOO所致DO為臨床最為常見的類型，本課題擬針對(duì)

5、BOO性DO的發(fā)生機(jī)理展開研究。在“肌源性”學(xué)說所提出的重要機(jī)理方面，認(rèn)為“逼尿肌興奮性升高與DO有著密切的關(guān)系”。但我們廣泛查閱了相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，這一重要的機(jī)理尚缺乏直接的證據(jù)支持。為此，以此做為課題的切入點(diǎn)。首先，第一部分應(yīng)用目前研究細(xì)胞興奮性最好的技術(shù)-穿孔膜片鉗全細(xì)胞記錄，在具有“真電流鉗”功能的新型膜片鉗放大器EPC-10上，選取評(píng)價(jià)興奮性的可靠指標(biāo)，對(duì)BOO性DO大鼠逼尿的興奮性與正常逼尿肌進(jìn)行檢測(cè)與比較。然后，進(jìn)一步研究這

6、種高興奮狀態(tài)的具體分子機(jī)理(離子通道機(jī)制)，選取在調(diào)控正常逼尿肌興奮性中具有最重要作用的電壓依賴性鈣通道(VDCC)和大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKca)作為主要研究對(duì)象，對(duì)逼尿肌興奮的啟動(dòng)和抑制這兩個(gè)層面進(jìn)行考察。沿著這條主線，在第二部分中主要針對(duì)VDCC中的L型和T型的變化進(jìn)行探索。綜合應(yīng)用膜片鉗技術(shù)、激光共聚焦逼尿肌鈣熒光探針濃度測(cè)量并結(jié)合相應(yīng)的藥理學(xué)工具，對(duì)BOO性DO逼尿肌VDCC中的L和T性鈣通道的電學(xué)特性及其在細(xì)胞靜息鈣濃度調(diào)控

7、進(jìn)行檢測(cè)并與正常逼尿肌進(jìn)行比較，明確鈣通道活動(dòng)的改變及其與高興奮性的關(guān)系；在第三部分，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，從單通道、全細(xì)胞電流密度以及瞬時(shí)外向鉀電流(STOCs)三個(gè)方面對(duì)BKca通道的活性改變進(jìn)行觀察和比較，同時(shí)應(yīng)用免疫印跡技術(shù)對(duì)BKca通道α、β亞單位的蛋白表達(dá)改變進(jìn)行比較，明確BKca蛋白表達(dá)和功能活動(dòng)的改變以及與高興奮狀態(tài)的關(guān)系。 材料和方法： 1.采用近端尿道不全結(jié)扎法制作PBOO性雌性大鼠DO動(dòng)物模型；

8、2.模型制作后6-8周應(yīng)用尿流動(dòng)力儀充盈性膀胱測(cè)壓篩選DO模型和對(duì)照。出現(xiàn)膀胱非排尿性收縮的尿道結(jié)扎大鼠作為DO組，無非排尿性收縮表現(xiàn)的正常同齡大鼠作為對(duì)照組； 3.采用消化酶法急性分離適合膜片鉗技術(shù)的單個(gè)逼尿肌細(xì)胞； 4.用以兩性霉素B為穿孔劑的穿孔膜片鉗電流鉗下記錄逼尿肌細(xì)胞的靜息電位、輸入膜阻抗、閾刺激、動(dòng)作電位閾電位等指標(biāo)； 5.用穿孔膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗下記錄逼尿肌L和T型鈣通道的峰值電流密度以及激活曲線

9、、穩(wěn)態(tài)失活曲線，及藥理學(xué)特性； 6.觀察L和T型鈣通道阻斷劑對(duì)Fluo-4AM鈣熒光探針標(biāo)記的逼尿肌細(xì)胞靜息鈣濃度的影響； 7.在穿孔膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗模式下記錄BKca全細(xì)胞電流和STOCs電流，分析全細(xì)胞電流密度，STOCs平均電流幅度及平均發(fā)放頻率。 8.應(yīng)用inside-out膜片記錄逼尿肌BKca單通道電流，并對(duì)單通道特性進(jìn)行電學(xué)和藥理學(xué)鑒定，分析開放概率、平均開放時(shí)間、平均關(guān)閉時(shí)間、電導(dǎo)等參數(shù)；

10、 9.應(yīng)用western blot技術(shù)對(duì)BKcaα、β亞單位蛋白表達(dá)情況進(jìn)行比較。 結(jié)果： (一)成功建立了大鼠BOO性DO動(dòng)物模型，模型成功率高達(dá)82.3％。 (二)成功建立了一種逼尿肌細(xì)胞急性酶分離方法，具有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，并且適于膜片鉗研究。 (三)成功地將穿孔膜片鉗技術(shù)技術(shù)應(yīng)用在大鼠逼尿肌膜電位記錄上，最大程度地反應(yīng)了逼尿肌的電生理特性。 (四)對(duì)DO和正常逼尿肌細(xì)胞興奮性進(jìn)行

11、了各預(yù)設(shè)指標(biāo)的檢查，結(jié)果分析表明，BOO性DO逼尿肌細(xì)胞興奮性較正常顯著增加，這可能是DO發(fā)生的重要原因。 (五)首次成功地進(jìn)行了逼尿肌細(xì)胞的穿孔膜片鉗電壓依賴性鈣通道電流的記錄 (六)DO逼尿肌L型鈣通道發(fā)生變化，表現(xiàn)為： 1.通道的密度顯著增加，激活后可引起更多的鈣內(nèi)流，這可能是DO后逼尿肌收縮力增強(qiáng)的原因之一。 2.通道失活曲線右移，處于失活狀態(tài)的L型鈣通道比例減少，提示：L型鈣通道阻斷劑需要使用更

12、大的濃度才能將其完全抑制。 (七)DO逼尿肌T型鈣通道發(fā)生變化，表現(xiàn)為： 1.通道的密度顯著增加。 2.通道失活曲線右移，激活曲線左移使得靜息狀態(tài)下T通道的“windowcurrent”(窗電流)增大，這是DO逼尿肌靜息鈣濃度增加的重要原因之一； 3.通道激活曲線左移，這可能是DO興奮性增加的重要原因。 4.T型鈣通道對(duì)于正常和DO逼尿肌中的靜息鈣濃度均有顯著的調(diào)控作用，這是通過其窗電流實(shí)現(xiàn)的。使

13、用T型鈣通道阻斷劑后，鈣熒光的前后變化率DO逼尿肌大于正常逼尿肌，證明T型鈣通道形成窗電流在DO逼尿肌是上調(diào)的。 (八)DO逼尿肌BKca全細(xì)胞電流密度顯著下降。 (九)DO逼尿肌BKca單通道活動(dòng)顯著下降，具體為開放概率、平均開放時(shí)間下降而平均關(guān)閉時(shí)間以及單通道電導(dǎo)未發(fā)生改變。同時(shí)，單通道對(duì)鈣敏感性下降。 (十)DO逼尿肌瞬時(shí)外向鉀電流(STOCs)的幅度以及頻率顯著下降.。 (十一)DO逼尿肌BKca

14、通道α、β亞單位蛋白表達(dá)顯著下降。 結(jié)論： 一、梗阻性DO逼尿肌細(xì)胞興奮性顯著高于正常逼尿肌，這可能是BOO后發(fā)生DO的重要原因。 二、DO逼尿肌細(xì)胞L和T性鈣通道密度增加，動(dòng)力學(xué)發(fā)生諸多改變。這些改變易化了DO逼尿肌產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力，是其興奮性升高的重要離子基礎(chǔ)。 三、DO逼尿肌中BKCa通道的蛋白表達(dá)和通道活動(dòng)均出現(xiàn)顯著的削弱，這使得其抑制細(xì)胞興奮的能力嚴(yán)重減弱，這些變化也是DO逼尿肌興奮性升高重要