機械牽張對豚鼠膀胱ICC細胞興奮性的影響及其與逼尿肌不穩(wěn)定的關(guān)系.pdf

1、背景及目的：儲/排尿是膀胱的主要生理功能。這一功能受到來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的支配和控制，神經(jīng)因素長期以來被認為是膀胱功能調(diào)節(jié)最經(jīng)典甚至是惟一的調(diào)控方式。但是有研究表明膀胱逼尿肌在失去神經(jīng)控制的狀態(tài)下，仍然存在自發(fā)性的收縮，目前越來越多的證據(jù)顯示膀胱源性因素也參與了膀胱功能的調(diào)節(jié)。這些因素包括膀胱上皮細胞的分泌功能、逼尿肌細胞之間的縫隙連接和信號傳遞以及膀胱壁內(nèi)的一些特殊的細胞群等等。這些膀胱自身的調(diào)控因素在膀胱逼尿肌興奮的起源和調(diào)控機制尚待

2、進一步闡明。神經(jīng)因素之外的膀胱自身調(diào)控因素如何參與膀胱的興奮性控制，他們與經(jīng)典的神經(jīng)調(diào)控機制之間的關(guān)系毫無疑問地成為了膀胱功能調(diào)節(jié)嶄新的研究方向。 既然膀胱具有自發(fā)的興奮性，而同樣具有自發(fā)性興奮的器官如心臟和胃腸道等都有一個共同的特點，自發(fā)的興奮性與某些特殊分化的細胞群有密切的關(guān)系。因此很多研究人員都自然而然地聯(lián)想到膀胱中是否存在這樣一群類似的細胞。新近的報道以及我們的研究中發(fā)現(xiàn)：膀胱中的確存在一種特殊的間質(zhì)細胞，這種細胞和胃腸

3、道卡哈爾間質(zhì)細胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)類似，有特異性的c-kit酪氨酸激酶受體的表面標(biāo)志。很多研究都業(yè)已證實胃腸道的ICC細胞參與了胃腸道蠕動功能的調(diào)節(jié)，而在某些由于ICC細胞缺失或功能失調(diào)導(dǎo)致的先天性胃腸道功能紊亂性疾病中同時也伴有膀胱功能障礙。因此我們推測ICC細胞可能參與了膀胱功能的調(diào)節(jié)，并且作為一種重要的膀胱源性因素，影響了膀胱的自發(fā)性興奮收縮以及膀胱功能的調(diào)控。ICC細胞作為胃腸道中

4、的“起搏細胞”，在調(diào)節(jié)胃腸道動力的病理生理學(xué)機制方面起到重要的作用。目前的研究表明，ICC細胞是一種具有多種功能的特殊間質(zhì)細胞，它們的主要功能是產(chǎn)生和傳播胃腸道基本電節(jié)律(Basic electrical rhythm，BER)、整合神經(jīng)調(diào)控以及感受胃腸道的機械牽張刺激。近年來的研究表明，在包括人在內(nèi)的多種屬的泌尿系統(tǒng)中，也存在著這樣一些特殊的間質(zhì)細胞，它們可分布在輸尿管、膀胱、尿道、前列腺、陰莖海綿體，但是對這些特殊的細胞的功能知之甚

5、少，命名也尚不統(tǒng)一，它們曾被稱作如膀胱間質(zhì)細胞、非典型平滑肌細胞、ICC樣間質(zhì)細胞、類ICC細胞等等。這些細胞的廣泛分布和潛在的功能開啟了泌尿系統(tǒng)相關(guān)研究的一個新領(lǐng)域，雖然這類間質(zhì)細胞和胃腸道ICC細胞有類似的形態(tài)學(xué)特征和某些生理學(xué)功能(如自發(fā)興奮性等)，但很多研究也表明其與胃腸道ICC有明顯的差別，胃腸道ICC細胞的功能亦尚未——在膀胱ICC細胞中得到印證。為了規(guī)范名稱便于交流，2007年的第五屆國際Caj al間質(zhì)細胞論壇建議將泌尿

6、系這一類與胃腸道ICC有相似形態(tài)學(xué)特征和免疫學(xué)標(biāo)志的間質(zhì)細胞命名為泌尿系ICC細胞，本文中對于該類細胞的命名也借鑒了上述標(biāo)準(zhǔn)。在以往的研究中，已經(jīng)明確的觀察到ICC細胞在泌尿道的分布以及形態(tài)學(xué)特征，甚至從組織中將他們分離出來進行培養(yǎng)和研究他們的免疫學(xué)、生理學(xué)特性，但是到目前為止，泌尿系ICC細胞究竟如何參與和調(diào)節(jié)泌尿系統(tǒng)的功能仍然沒有定論。 細胞的生物機械環(huán)境對于細胞的正常生長發(fā)育，相互作用及其特殊功能的發(fā)揮都有重要的影響，在眾

7、多的機械刺激當(dāng)中，機械牽張刺激是最為常見的。膀胱在生理狀態(tài)下，感受不斷產(chǎn)生的尿液對膀胱壁的充盈刺激是調(diào)節(jié)膀胱排空的重要因素。目前的研究表明：在體條件下，當(dāng)膀胱內(nèi)容量充盈到一定程度時，即產(chǎn)生足夠的牽張刺激，使逼尿肌興奮性增高，誘發(fā)其收縮，從而啟動膀胱的排空；而在離體條件下，膀胱逼尿肌條受到牽張刺激時逼尿肌細胞可產(chǎn)生自發(fā)性的興奮，啟動肌條的節(jié)律性收縮，這種收縮在膀胱失去神經(jīng)支配和多種神經(jīng)受抑制劑(包括河豚毒素)作用下仍然存在。而在某些病理狀

8、態(tài)下，如逼尿肌不穩(wěn)定中，上述牽張誘導(dǎo)的肌條活動表現(xiàn)為同樣張力條件下不穩(wěn)定逼尿肌較正常逼尿肌收縮頻率增高。因此機械牽張在啟動膀胱源性逼尿肌收縮和控制逼尿肌興奮性中有重要作用。 我室以往的研究表明：正常豚鼠膀胱中存在c-kit陽性的ICC細胞，可主要分布于膀胱粘膜下、逼尿肌肌束之間以及逼尿肌肌束內(nèi)部。膀胱ICC細胞可產(chǎn)生自發(fā)性起搏電位If，可能與逼尿肌的自發(fā)性收縮關(guān)系密切；膀胱不同部位的ICC細胞有著不同的分布密度，三角區(qū)的膀胱IC

9、C細胞密度最高，而與之相對應(yīng)的部位逼尿肌條的自發(fā)性收縮頻率更高，提示膀胱中可能存在興奮的最高控制點，即起搏點，而膀胱ICC細胞可能和起搏功能有密切關(guān)系；另外我們還發(fā)現(xiàn)ICC細胞可以對ATP、卡巴膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)或類似物產(chǎn)生興奮樣沖動，膀胱內(nèi)灌注ATP可誘發(fā)大鼠盆神經(jīng)放電，用c-kit特異性抑制劑甲磺酸依馬替尼阻斷ICC細胞功能后，盆神經(jīng)放電頻率明顯降低，提示ICC細胞極有可能參與了ATP介導(dǎo)的膀胱感覺傳入，ICC細胞可能作為神經(jīng)末梢調(diào)控逼

10、尿肌細胞收縮“中轉(zhuǎn)站”的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)發(fā)揮了重要的中介作用。而膀胱ICC細胞的潛在起搏功能和神經(jīng)傳遞功能都來自基于胃腸道ICC細胞功能的延伸和推測，因此我們有理由相信膀胱ICC細胞可能和胃腸道ICC細胞一樣，也可通過感受機械牽張刺激參與了膀胱逼尿肌收縮功能的調(diào)控。而這種特殊的牽張感受功能對我們理解膀胱源性的逼尿肌自發(fā)性興奮從而進一步認識儲尿排尿生理和病理狀態(tài)下的膀胱功能異常都有重要的意義。 綜上所述，膀胱逼尿肌具有自發(fā)性興奮，機械牽張

11、刺激可誘導(dǎo)膀胱逼尿肌發(fā)生周期性的收縮，而膀胱中的ICC細胞是不是這種自發(fā)性興奮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)？膀胱ICC細胞是否具有牽張敏感特性？在膀胱功能異常的情況下ICC細胞的結(jié)構(gòu)和功能會不會發(fā)生變化？對這些問題進行深入的探索具有重要的科學(xué)研究意義，并將為逼尿肌興奮性調(diào)控相關(guān)研究開創(chuàng)新的領(lǐng)域，為膀胱功能障礙性疾病的發(fā)病機制研究提供一個全新的切入點。 本課題通過體內(nèi)慢性梗阻和體外培養(yǎng)細胞的機械牽張模型研究ICC細胞的形態(tài)、數(shù)量以及興奮性的變化，探

12、討膀胱ICC細胞的機械牽張敏感性及其在逼尿肌不穩(wěn)定中的可能機制。 我們擬從以下幾個方面進行研究：第一：通過膀胱頸部分梗阻(partial bladder outletobstruction，PBOO)建立豚鼠逼尿肌不穩(wěn)定動物模型，并比較梗阻后膀胱ICC細胞的形態(tài)、數(shù)量及分布的變化，研究ICC細胞在膀胱流出道梗阻狀態(tài)下的適應(yīng)性改變；第二：觀察PBOO膀胱和正常膀胱內(nèi)ICC細胞的自發(fā)鈣活動的變化，探討ICC細胞在PBOO后的功能改變

13、以及在逼尿肌不穩(wěn)定(detrusor overactivity，DO)發(fā)病機制中的可能作用；第三：構(gòu)建體外培養(yǎng)細胞機械牽張裝置，通過對體外培養(yǎng)的膀胱ICC細胞施加靜態(tài)牽張力的作用，觀察ICC細胞內(nèi)牽張誘導(dǎo)鈣瞬變(stretch-induced calcium transient，SICT)的特征；第四：通過施加一定的鈣離子阻斷因素，包括清除細胞外鈣離子、RYR或IP3敏感鈣庫抑制等探討ICC細胞SICT的來源和初步作用機制。 方

14、法： 1.本研究以2-3月齡豚鼠為研究對象，尿道近端結(jié)扎法制作膀胱流出道部分梗阻模型，并設(shè)假手術(shù)組為對照，6周后行充盈性膀胱測壓，根據(jù)測壓結(jié)果將動物分為梗阻后逼尿肌不穩(wěn)定組(DO組)、梗阻后逼尿肌穩(wěn)定組(DS組)和對照組。各組分別行c-kit免疫熒光組織染色，激光共聚焦觀察ICC細胞的形態(tài)和分布情況； 2.流式細胞儀檢測各組c-kit陽性細胞數(shù)量的變化；為排除肥大細胞的干擾(因為膀胱中的肥大細胞也可表現(xiàn)為c-kit染色陽

15、性)以驗證流式細胞儀的結(jié)果，在激光共聚焦顯微鏡下對各組膀胱組織標(biāo)本行ICC細胞計數(shù)； 3.利用StageFlexer硅酮膜、聚乙烯齒梳、3140密封膠以及普通細胞培養(yǎng)皿等材料制作體外水平機械牽張裝置，并與低滲溶液誘導(dǎo)細胞膨脹進行比較； 4.膠原酶消化膀胱組織，體外培養(yǎng)ICC細胞72h并通過c-kit免疫熒光細胞染色進行鑒定； 5.活細胞鈣熒光指示劑Fluo-4AM負載急性分離貼壁的細胞，激光共聚焦動態(tài)觀察DO組、

16、DS組和對照組膀胱ICC細胞自發(fā)鈣活動的變化情況； 6.將正常膀胱ICC細胞培養(yǎng)于體外水平機械牽張裝置中72h牢固貼壁后，通過梯度機械牽張刺激觀察ICC細胞在機械牽張負荷下的SICT變化情況； 7.利用無鈣HBSS緩沖液、RYR鈣庫特異性阻斷劑釘紅(Ruthenium red，RU)或IP3敏感鈣庫特異性阻滯劑2一氨基乙氧基苯硼酸(2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)處理體外培養(yǎng)的ICC

17、細胞，探討胞外鈣離子內(nèi)流以及胞內(nèi)鈣庫釋放在ICC細胞自發(fā)性鈣活動以及SICT產(chǎn)生機制中的作用。 結(jié)論： 1.PBOO后豚鼠膀胱內(nèi)ICC細胞的形態(tài)、數(shù)量、分布以及自發(fā)性鈣活動的特征均發(fā)生了改變，并且和DO的發(fā)生有直接關(guān)系，提示ICC細胞的一系列適應(yīng)性變化有可能是導(dǎo)致DO的病理基礎(chǔ)； 2.機械牽張能誘導(dǎo)ICC細胞的興奮狀態(tài)改變，提示ICC細胞有牽張敏感的特性，并且對相同的機械牽張刺激ICC細胞比平滑肌細胞更為敏感，鈣