伽瑪?shù)墩丈鋵Πd癇大鼠興奮性癇性發(fā)作機(jī)制的干預(yù).pdf

1、第一章成年大鼠海馬腦片神經(jīng)細(xì)胞電生理特性及MK801對癇性放電的干預(yù) 目的：探討 Glu 及 KA 噴浴對大鼠海馬腦片的興奮性損傷機(jī)制及MK801對癇性放電的干預(yù)效應(yīng)。 方法：(1)腦片制作：成年Wistar大鼠，7～8周齡，體重200g±10g。斷頭取出腦組織，按海馬長軸切成厚約300μm的薄片。將全部腦片迅速置于95％O<,2>和5％CO<,2>混合氣體飽合的ACSF的容器內(nèi)，放入35～37℃的恒溫水浴箱中水浴1小時(shí)

2、，再移入24～25℃的恒溫水浴箱中再水浴3～4小時(shí)待用。(2)采用膜片鉗全細(xì)胞模式進(jìn)行觀察：①海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的基本電生理特性、對Glu、GABA 的反應(yīng)；③Na<'+>、K<'+>、Ca<'2+>全細(xì)胞電流測定；③Glu、KA誘導(dǎo)海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞癇性放電的特性及影響因素；MK801對海馬腦片神經(jīng)細(xì)胞癇性放電的影響。 結(jié)果： 1．孵育的海馬腦片細(xì)胞成活率大于80％，CA3區(qū)錐體細(xì)胞個(gè)大，細(xì)胞數(shù)目多而集中。神經(jīng)元細(xì)

3、胞表面光滑，反光一致，突起明顯。 2．成年大鼠海馬腦片神經(jīng)細(xì)胞封接有一定的難度，成功率約60％～ 70％(n=400)。細(xì)胞靜息電位為61.2±6.8mv(n=200)。根據(jù)C-slow 和G-series讀數(shù)，膜電容Cm和串聯(lián)阻抗Rs分別為16.36±2.7pF、10.03±1.7GΩ。時(shí)間常數(shù)t (=Cm×Rs)為159.4±41.23μs (n=57)。恒流電刺激可產(chǎn)生多個(gè)動(dòng)作電位，Glu 誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)可逆

4、性去極化，并產(chǎn)生陣發(fā)性動(dòng)作電位，GABA抑制電流刺激誘發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放。 3.全細(xì)胞模式下，可以記錄到呈電壓依賴性，快速激活并快速失活的內(nèi)向Na<'+>電流，外向K<'+>；Ca<'2+>電流為內(nèi)向電流，激活較慢，失活也較慢，電流在40mV時(shí)開始被激活，0mV時(shí)電流達(dá)到高峰，具有內(nèi)向整流的特征，當(dāng)普通細(xì)胞外液換成無鈣細(xì)胞外液時(shí)，該電流消失。 4.恒流電刺激、灌流Glu或KA均可見到>3Hz的自發(fā)性、陣發(fā)性或簇發(fā)性癇性放電

5、。噴射MK801可以抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞癇性放電，Glu組抑制率優(yōu)于KA組。 結(jié)論： 1.成年大鼠海馬具有有序的神經(jīng)元和纖維排列，其纖維和突觸部位容易定位，便于進(jìn)行電生理操作；經(jīng)過孵育的成年大鼠海馬腦片神經(jīng)細(xì)胞，具有完整的Na<'+>、K<'+>、Ca<'2+>離子通道。 2.恒流電刺激、Glu 和 KA 均對海馬細(xì)胞產(chǎn)生興奮性，均可致海馬神經(jīng)細(xì)胞反復(fù)自發(fā)性癇性放電。 3.MK801不僅能阻斷電刺激誘發(fā)的動(dòng)作

6、電位，而且還能抑制Glu或KA誘發(fā)的癇性放電，有利于神經(jīng)細(xì)胞維持正常神經(jīng)功能，減少不良反應(yīng)。 第二章伽瑪?shù)墩丈浼t藻酸癲痛大鼠后NMDAR表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究伽瑪?shù)墩丈浼t藻酸癲癇大鼠后，NMDAR在大鼠興奮性癇性損傷機(jī)制發(fā)生發(fā)展過程中的作用及調(diào)控機(jī)制。 方法：Wistar大鼠分成以下3個(gè)組：①A組，對照組(正常大鼠)；②B組，紅藻酸致癇模型大鼠組；③C組，伽瑪?shù)?40Gy，4mm)照射紅藻酸致癇大鼠

7、組。選取照射后7d、14d、21d、35d、49d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。用電生理記錄儀觀察癲癇發(fā)作次數(shù)；光鏡、電鏡、Timms染色觀察形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變；水迷宮觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能；NMDA 免疫組化觀察伽瑪?shù)墩丈浜蠼M織形態(tài)學(xué)改變；Western blotting、RT-PCR法檢測NMDA蛋白及其mRNA的表達(dá)，高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)Glu濃度，F(xiàn)ura-2/AM單波長熒光法測細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度的變化。 結(jié)果：

8、 1．伽瑪?shù)墩丈浜蟠笫蟀l(fā)作次數(shù)有顯著意義的減少(P<0.05)。 2．癲癇大鼠伽瑪?shù)墩丈浜笮螒B(tài)學(xué)改變以神經(jīng)元的損傷為主。表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體濃縮變性，異染色質(zhì)增加、邊聚、染色質(zhì)聚集。核皺縮變形，核膜不規(guī)則內(nèi)陷。 3．伽瑪?shù)墩丈浜?1～49天苔蘚纖維發(fā)芽明顯減少(P<0.05)。 4．伽瑪?shù)墩丈浜蟀d癇鼠的記憶功能改變與NMDA受體表達(dá)下降呈顯著性正相關(guān)(P=0.005，r=0.816)o 5．NMDA mRNA

9、表達(dá)顯著下調(diào)，與NMDA蛋白表達(dá)呈顯著性正相關(guān)(P=0.004，r=0.912)；與Glu濃度及細(xì)胞內(nèi)游離的Ca<'2+>濃度變化相一致。 結(jié)論：伽瑪?shù)?(40Gy、4mm準(zhǔn)直器)照射紅藻酸癲癇大鼠海馬可以明顯減少致癇大鼠癲癇發(fā)作頻率，并且對被照癲癇大鼠記憶功能無明顯損傷。伽瑪?shù)墩丈浼t藻酸癲癇大鼠可能通過直接或間接影響腦細(xì)胞內(nèi)Glu的濃度，調(diào)節(jié)NMDA mRNA的表達(dá)，引起Ca<'2+>濃度下降，Glu-NMDA-Ca<'2+>