啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)與炎癥細胞TNF-α分泌關(guān)系及調(diào)控因素的研究.pdf

1、研究目的：測定人單核細胞系THP-1細胞在炎癥刺激時腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達分泌的規(guī)律，確定其分泌峰值時間；研究TNF-α基因啟動子區(qū)域散在CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)甲基化狀態(tài)與蛋白分泌和基因表達的關(guān)系；探討TNF-α基因啟動子區(qū)域散在CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)甲基化狀態(tài)影響其基因表達的調(diào)控因素。
　　 研究方法：采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法檢測人單核細胞系THP-1細胞在未受到炎癥因子刺激時，其TNF-α表達分泌水平；使用終濃度為

2、 1 μg/ml的脂多糖（LPS）刺激人單核細胞系THP-1細胞，采用ELISA法檢測刺激不同時間時細胞培養(yǎng)液上清TNF-α分泌水平。對不同刺激時間分泌量與未刺激時分泌量進行比較，確定THP-1細胞在受到終濃度為 1 μg/ml的脂多糖刺激后，TNF-α分泌高峰時間和分泌下降時間。獨立進行4次上述測定，結(jié)果以刺激不同時間的分泌量與未刺激時分泌量比值的平均數(shù)±標準誤表示。對刺激后分泌高峰時間和分泌下降時間其分泌水平進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.

3、05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時采用實時定量PCR方法測定THP-1細胞TNF-α基因表達水平。采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化基因測序法測定THP-1細胞在未受到炎癥刺激時TNF-α基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。使用終濃度為1 μg/ml LPS刺激THP-1細胞，采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化基因測序法測定THP-1細胞在LPS刺激分泌高峰時TNF-α基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，以及受刺激后分泌下降時TNF-α基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。每個時間點樣本選取5個克

4、隆進行測序，結(jié)果以所測得CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)甲基化數(shù)占擴增區(qū)域總CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)數(shù)的百分率表示。采用卡方檢驗對測序結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。將未刺激時、刺激分泌高峰時期、刺激分泌下降時期TNF-α表達分泌量與對應(yīng)時間點其基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行對比。使用實時定量PCR方法測定甲基化CpG結(jié)合蛋白表達量。并與相應(yīng)時間點TNF-α基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)及TNF-α分泌的關(guān)系進行研究。
　　 實驗結(jié)

5、果：受到終濃度為1 μg/ml的LPS刺激后，THP-1細胞迅速開始產(chǎn)生TNF-α，1 h過后升幅明顯增加，在4 h達到分泌高峰水平，濃度為未刺激時的48.9±1.06倍。之后快速下降，至8 h，已有明顯下降，濃度為未刺激時的36.3±1.65倍。至12 h，濃度已降至峰值一半以下。刺激4 h與未刺激時相比，TNF-α分泌量明顯升高，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義。刺激8 h與刺激4 h相比，TNF-α分泌量明顯下降，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義。TNF-α

6、基因啟動子區(qū)域無典型CpG島結(jié)構(gòu)，其啟動子-344 bp到+57 bp區(qū)域內(nèi)，存在12個散在CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)，其中-344 bp到轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）區(qū)域內(nèi)，存在11個散在CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)。未受到LPS刺激時，該11個散在CpG雙核苷酸均處于甲基化狀態(tài)；刺激4 h時，有4個處于甲基化狀態(tài)；刺激8 h時，有9個處于甲基化狀態(tài)。未刺激時，5個克隆總體甲基化率為100％，刺激4 h時，5個克隆總體甲基化率為21.8％，刺激8 h時，5個

7、克隆總體甲基化率為41.8％。刺激4 h時與未刺激時相比，TNF-α基因啟動子區(qū)域甲基化率明顯下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；刺激8 h時與刺激4 h時相比，TNF-α基因啟動子區(qū)域甲基化率明顯上升，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。各時間點甲基化率與相應(yīng)時間點TNF-α分泌量比值之間呈明顯負相關(guān)。未受到LPS刺激時,甲基化結(jié)合蛋白（MBD1、MBD2、MeCP2）表達量均較高；刺激4 h后，MeCP2表達量明顯降低。MBD1、MBD2表達量較低；刺激8

8、h后，MBD1、MBD2、MeCP2表達量又升高。
　　 實驗結(jié)論：
　　 1．THP-1細胞TNF-α表達分泌量與LPS刺激明顯相關(guān)。未受到LPS刺激時，TNF-α表達分泌量較低。受到LPS刺激后迅速開始產(chǎn)生TNF-α，1 h過后升幅明顯增加，在4 h時達到分泌高峰水平，之后快速下降,至8 h時，已有明顯下降。TNF-α表達分泌呈現(xiàn)快速開始，快速升高并快速下降的規(guī)律。
　　 2．TNF-α基因啟動子區(qū)域散在Cp