慢性乙型肝炎患者PD-1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、第一部分、慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞表面的PD-1表達(dá)及其影響因素的研究
　　 目的：研究慢性乙型肝炎患者外周血外周血單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1的情況以及影響PD-1表達(dá)的可能的因素。
　　 方法：密度梯度離心法分離63例慢性乙型肝炎患者(其中包括HBeAg(+)患者32例，HBeAg（-）患者31例）、35例乙肝病毒健康攜帶者、18例健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞

2、中表達(dá)PD-1的百分比，分析慢性乙型肝炎患者、乙肝病毒健康攜帶者及健康人PD-1表達(dá)的差異;觀察PD-1表達(dá)與HBV感染者ALT水平、乙肝e抗原、病毒復(fù)制指標(biāo)HBV-DNA水平之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：HBV健康攜帶組外周血單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率最高;CHB組次之;健康對(duì)照組最低。HBV健康攜帶組外周血單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組及CHB組，CHB組

3、顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.05)。而CD8+T淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)只在健康對(duì)照組和HBV健康攜帶組之間比較差異顯著(P＜0.05)，其他組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)PD-1百分比與血清ALT及HBV-DNA水平無(wú)相關(guān)性。CHB患者eAg是否陽(yáng)性對(duì)PD-1在外周血單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)率有一定影響: HBeAg(+)組和HBeAg（-）組外周血單個(gè)

4、核細(xì)胞表面表達(dá)PD-1比率分別為:25.88±20.09％和15.39±10.64％，較健康對(duì)照組(10.85±4.45％)明顯升高，HBeAg(+)組和健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);HBeAg(+)組PD-1表達(dá)比率顯著高于HBeAg（-）組，P＜0.01。HBeAg(+)組、HBeAg（-）組、健康對(duì)照組CD4+T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)PD-1表達(dá)率分別為:9.15±6.46％、8.65±6.84％、2.37±1.16

5、％，HBeAg(+)組及HBeAg（-）組健與康對(duì)照組CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。HBeAg(+)組、HBeAg（-）組、健康對(duì)照組CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率分別為:3.71±2.79％、3.23±2.39％、1.40±0.31％，HBeAg(+)組及HBeAg（-）組健與康對(duì)照組CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　 結(jié)論：CH

6、B患者外周血單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)顯著高于健康人，又明顯低于HBV健康攜帶者。PD-1表達(dá)可能與HBV感染者的免疫狀態(tài)相關(guān)。血清HBeAg可以明顯影響CHB患者外周血T單個(gè)核細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，是影響其PD-1表達(dá)的重要因素。
　　 第二部分、淋巴細(xì)胞系Molt-4細(xì)胞PD-1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平和PD-1表達(dá)的關(guān)系的研究
　　 目的：以T淋巴細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞為模型，探討甲基化抑制劑5-雜

7、氮胞苷（5-Zac）對(duì)淋巴細(xì)胞表面程序性死亡受體-1(PD-1)基因啟動(dòng)子的去甲基化作用及其誘導(dǎo)的PD-1基因表達(dá)的改變，并進(jìn)一步研究去甲基化作用與PD-1基因表達(dá)之間關(guān)系。
　　 方法：以不同濃度的5-Zac（0μ mol·L-1、5μ mol·L-1、10μ mol·L-1）作用于體外培養(yǎng)的molt-4細(xì)胞72h，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)PD-1的Molt-4細(xì)胞比例和細(xì)胞凋亡率;反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PC

8、R)檢測(cè)5-Zac作用后PD-1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;亞硫酸氫鈉處理各組Molt-4細(xì)胞DNA，PCR擴(kuò)增PD-1啟動(dòng)子基因片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑克隆測(cè)序，檢測(cè)擴(kuò)增的PD-1啟動(dòng)子片段甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：0μ mol·L-1、5μ mol·L-1、10μ mol·L-1的5-氮雜胞苷作用于molt-4細(xì)胞72h后，PD-1在細(xì)胞表面的表達(dá)率分別為:1.13±0.01％;18.96±1.87％;63.09±6.25％

9、，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性;PD-1基因mRNA表達(dá)量顯著增加;細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示與未處理組相比，加5μ mol·L-1、10μ mol·L-1的5-氮雜胞苷處理72h后molt-4細(xì)胞的凋亡率顯著增加，三組凋亡率分別為:1.9％±0.06％;8.98％±1.36％;24.5％±3.68％，有顯著性差異(P＜0.01);三組DNA亞硫酸氫鈉測(cè)序結(jié)果表明，加入甲基化抑制劑5-Zac處理后，PD-1啟動(dòng)子上-601bp和d-553bp CG點(diǎn)去甲

10、基化程度明顯增高。
　　 結(jié)論：甲基化抑制劑5-Zac可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞系Molt-4細(xì)胞表面程序性死亡受體-1(PD-1)表達(dá)顯著增加，PD-1基因mRNA表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率增高，這種增高可能與PD-1基因啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)的低甲基化有關(guān)。
　　 第三部分：慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞PD-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)及影響因素
　　 目的：探討慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上程序性死亡受體-1表達(dá)和

11、PD-1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的關(guān)系，以及HBeAg對(duì)慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面PD-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)的影響。
　　 方法：篩選健康對(duì)照組10例、慢性乙型肝炎患者HBeAg陽(yáng)性者10例、慢性乙型肝炎患者HBeAg陰性者10例，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中PD-1基因的mRNA表達(dá)水平;亞硫酸氫鈉處理PBMCs細(xì)胞DNA，PCR擴(kuò)增PD-1啟動(dòng)子基因片段，轉(zhuǎn)化感受

12、態(tài)大腸桿菌，挑克隆測(cè)序，檢測(cè)擴(kuò)增的PD-1啟動(dòng)子片段甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組(0.10±0.023)比較，慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中PD-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高。在慢性肝炎患者中，外周血單個(gè)核細(xì)胞上PD-1表達(dá)在HBeAg陽(yáng)性患者(0.44±0.046)中顯著高于HBeAg陰性患者(0.18±0.014)。PD-1啟動(dòng)子上多個(gè)CpG點(diǎn)(-601、-553、-538、-483、-463、-317)甲基化