動(dòng)脈粥樣硬化與12-15-LOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的關(guān)系.pdf

1、背景：
　　建立合適的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)動(dòng)物模型是研究其發(fā)病機(jī)制及探討治療措施的重要前提條件，人類動(dòng)脈粥樣硬化(AS)以及動(dòng)脈硬化尚無完美的動(dòng)物模型。目前國內(nèi)建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型有多種選擇，猴、雞、兔等動(dòng)物易感性較高,容易培養(yǎng)成AS標(biāo)本。大鼠不僅具有AS的特性，而且飼養(yǎng)方便、成本低廉、獲取容易、應(yīng)用范圍廣泛,所以人們還是把其作為AS模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且不斷地進(jìn)行摸索以建立成熟的大鼠動(dòng)脈硬化模型

2、。
　　12/15-LOX(12/15-脂氧合酶，12/15-lipoxygenase)是一種非鐵血紅素氧化酶，在人體內(nèi)不僅可以氧化游離的多不飽和脂肪酸（如花生四烯酸、亞油酸），也可直接氧化復(fù)雜底物如磷脂、膽固醇脂以及低密度脂蛋白中的膽固醇脂。它的氧化產(chǎn)物參與多種炎性信號途徑，與血管炎癥反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)。早期研究認(rèn)為12/15-LOX可氧化低密度脂蛋白，因此具有促動(dòng)脈粥樣硬化作用。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，動(dòng)脈粥樣硬化鼠12/15-LO

3、X的活性增高或過表達(dá)可加速早期動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，而抑止12/15-LOX及其產(chǎn)物的活性或敲除12/15-LOX基因則可顯著延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。然而關(guān)于兔動(dòng)脈粥樣硬化模型的研究卻顯示，該酶具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。這些相悖的結(jié)論表明12/15-LOX的表達(dá)調(diào)控在其參與動(dòng)脈粥樣硬化病理生理作用的機(jī)制中有重要意義。12/15-LOX的表達(dá)有高度的細(xì)胞和組織特異性。DNA甲基化是最常見的復(fù)制后及轉(zhuǎn)錄前修飾方式之一，在基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育

4、調(diào)節(jié)、基因組印跡等方面發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)去甲基化是12/15-LOX基因轉(zhuǎn)錄激活的必要條件，在12/15-LOX的組織以及器官特異性表達(dá)中起重要作用。因此對體內(nèi)12/15-LOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究，將有助于進(jìn)一步探討動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理，從而為冠心病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.高脂飲食喂養(yǎng)＋維生素D3注射，成功建立動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型；2.檢測動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊

5、區(qū)的12/15-LOX啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)；3.比較動(dòng)脈粥樣硬化大鼠斑塊血管組織和非動(dòng)脈粥樣硬化大鼠正常血管組織中12/15-LOX的表達(dá)情況。
　　方法：
　　（1）將40只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，即對照組和模型組，每組20只。模型組：給予高脂飲食喂養(yǎng)加維生素D3注射；對照組正常飲食。3個(gè)月后，處死大鼠，取其主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈的血管組織，各取0.8cm分別作蘇木精－伊紅染色和油紅O染色油紅O染色，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。（2）用

6、改進(jìn)的半定量甲基化特異性PCR法檢測血管組織中12/15-LOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，并計(jì)算甲基化特異性條帶和非甲基化特異性條帶的吸光度（A）比值。
　　結(jié)果：
　?。?）經(jīng)蘇木精－伊紅染色和油紅O染色，顯微鏡下觀察可見模型組血管內(nèi)膜下有多處斑塊，大小不等，斑塊中可見數(shù)目不等的泡沫細(xì)胞，有的可見纖維組織增生伴片狀或點(diǎn)狀鈣化，中膜萎縮，呈較典型的成熟AS斑塊，對照組，內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞完

7、整，中膜主要見梭形平滑肌細(xì)胞。（2）根據(jù)甲基化特異性條帶和非甲基化特異性條帶的吸光度（A）比值，把全部血管組織分為低甲基化狀態(tài)和高甲基化狀態(tài)。當(dāng)樣本中含有甲基化12/15-LOX基因時(shí)，可用M引物擴(kuò)增出條帶，而用引物U則不能擴(kuò)增出條帶，而當(dāng)樣本中含有非甲基化的12/15-LOX基因時(shí)，用引物U可擴(kuò)增出條帶，而用引物M則擴(kuò)增不出條帶，模型組斑塊區(qū)血管組織中12/15-LOX基因啟動(dòng)子低甲基化檢出率為85％（17/20），而對照組低甲基化檢