BLyS-APRIL及其受體參與免疫性關(guān)節(jié)炎T細(xì)胞反應(yīng)的機(jī)制及重組TACI-Ig融合蛋白的治療作用.pdf

1、B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS)是腫瘤壞死因子超家族成員之一,主要來源于骨髓家族細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、惡性B細(xì)胞等。增殖誘導(dǎo)配體(a proliferation-inducing ligand, APRIL)是與BLyS關(guān)系十分密切的腫瘤壞死因子(tumor neurosis factor, TNF)超家族同系物。BLyS/APRIL通過相應(yīng)受體跨膜活化子和C

2、AML作用子( transmembrane Activator and CAML Interactor, TACI)、B細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)和B細(xì)胞活化因子受體(B cell-activating factor receptor, BAFF-R)結(jié)合,調(diào)節(jié)B細(xì)胞池的大小和功能,促進(jìn)B細(xì)胞不同發(fā)育階段免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)類別轉(zhuǎn)換和重組,是B細(xì)胞發(fā)育、存

3、活和活化的重要調(diào)節(jié)因子。近年來,人們發(fā)現(xiàn)活化的T細(xì)胞也產(chǎn)生BLyS和APRIL,而且表達(dá)BAFF-R和TACI兩種受體, BLyS/APRIL在輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper lymphocyte, Th)的分化、活化中發(fā)揮重要作用,但在T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)中的作用未見報(bào)道。
　　TACI-Ig是由TACI分子細(xì)胞外部分與人IgG的Fc段通過生物工程技術(shù)構(gòu)建的融合蛋白,作為一種誘騙受體,能夠競爭性結(jié)合BLyS和APRIL,

4、阻止BLyS和APRIL與相應(yīng)的受體結(jié)合,阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。為了探討B(tài)LyS/APRIL在Th介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)中的作用,本研究選用佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis, AA)大鼠,一種由T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子所介導(dǎo),以細(xì)胞免疫為主導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)動(dòng)物模型,研究BLyS/APRIL對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)及其機(jī)制,觀察TACI-Ig對(duì)大鼠AA

5、的治療作用。
　　目的:
　　建立免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型,觀察BLyS和APRIL及其受體(BCMA、TACI、BAFF-R)在T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)中的作用,分析BLyS水平與關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性,研究TACI-Ig對(duì)免疫性關(guān)節(jié)炎的治療作用,初步探討B(tài)LyS/APRIL及其受體在調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)中的作用和機(jī)制。
　　方法:
　　SD大鼠右后足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuv

6、ant, CFA)建立大鼠AA模型。造模成功后,將大鼠隨機(jī)分為8組:正常組,模型組,TACI-Ig(0.7、2.1、6.3 mg/kg, sc, d16~d34)治療組,rhTNFR:Fc(2.8 mg/kg, sc, d16~d34)和MTX(0.5mg/kg, ig, d16~d34)陽性對(duì)照藥,IgG-Fc(6.3 mg/kg, sc, d16~d34)陰性對(duì)照藥。
　　足容積法測量繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度;關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分測定;X線

7、攝片觀察四肢關(guān)節(jié)破壞情況;光學(xué)顯微鏡觀察踝關(guān)節(jié)和脾臟組織病理學(xué)變化;ELISA法檢測血清中IL-1β, TNF-α, PGE2, BLyS, APRIL, IL-17, IL-2, IL-10, TGF-β1, IFN-γ, IgG1, IgG2a, IgM和IgA水平,以及滑膜組織勻漿BLyS和APRIL水平;免疫組化法檢測脾臟中BLyS, CD3, CD20和CD68和滑膜組織中BLyS, APRIL, CD21, CD138和PN

8、Ad表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測外周血和脾臟總(CD3+CD4+)、活化(CD4+CD25+);記憶(CD4+CD44+)和未致敏(CD4+CD62L+)CD4+T細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠AA模型的制備與評(píng)價(jià)
　　FCA誘導(dǎo)大鼠 AA模型,繼發(fā)病變表現(xiàn)為以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的關(guān)節(jié)腫脹變形和活動(dòng)障礙等類似人RA的癥狀。影像學(xué)檢查可見AA大鼠關(guān)節(jié)軟組織腫脹明顯,未見或罕見骨侵蝕和關(guān)節(jié)間隙改變等骨破壞現(xiàn)象。病理學(xué)結(jié)果表明

9、,AA大鼠關(guān)節(jié)腔積液,炎性滲出,滑膜細(xì)胞增生水腫,血管翳形成,滑膜組織內(nèi)小血管增生,擴(kuò)張充血,大量炎細(xì)胞浸潤,嚴(yán)重者炎性滑膜組織侵犯軟骨表面和軟骨下骨;AA大鼠脾臟可見白髓增生,生發(fā)中心出現(xiàn);紅髓增生、淤血,范圍增大。提示FCA誘導(dǎo)的大鼠AA模型制備成功。
　　2. T細(xì)胞亞群和細(xì)胞免疫功能失調(diào)是AA大鼠的重要特點(diǎn)和主要表現(xiàn)
　　與正常組相比,AA大鼠血清IL-2和IFN-γ(Th1細(xì)胞分泌)和IL-17(Th17細(xì)胞分泌)

10、水平明顯升高,IL-10(Th2細(xì)胞分泌)和TGF-β1(Treg細(xì)胞分泌)水平明顯降低;Th1/Th2、Treg/Th17比例失衡。AA大鼠外周血總(CD3+CD4+)、記憶(CD4+CD44+)和未致敏 CD4+T細(xì)胞(CD4+CD62L+)T細(xì)胞比例顯著降低;AA大鼠脾臟總(CD3+CD4+)、活化(CD4+CD25+)、記憶(CD4+CD44+)和未致敏CD4+T細(xì)胞(CD4+CD62L+)T細(xì)胞比例顯著降低。提示AA大鼠主要表

11、現(xiàn)為T細(xì)胞亞群和細(xì)胞免疫功能失調(diào)。
　　3. BLyS和APRIL及其受體參與了T細(xì)胞介導(dǎo)的AA
　　與正常組相比,AA大鼠外周血BLyS和APRIL水平升高,脾臟中BLyS表達(dá)增加。相關(guān)性分析表明血清BLyS與關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)以及病理學(xué)損傷密切相關(guān)。免疫組化和Western blot結(jié)果均表明,滑膜組織TACI和BCMA表達(dá)增加,BAFF-R表達(dá)減少。TACI-Ig降低BLyS和APRIL水平,調(diào)節(jié)BLyS/APRIL受體表達(dá),

12、進(jìn)一步說明了BLyS和APRIL及其受體在AA病理機(jī)制中的重要作用。
　　4. BLyS和APRIL是AA滑膜炎癥過程中的重要調(diào)節(jié)因子
　　與正常組相比,AA大鼠滑膜組織勻漿BLyS和APRIL水平明顯升高,免疫組化法結(jié)果表明BLyS和APRIL表達(dá)增加,且外周血BLyS水平與關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)損傷密切相關(guān)。TACI-Ig減少滑膜組織中 CD21(活化 B細(xì)胞)、CD138(漿細(xì)胞)和PNAd(血管形成)表達(dá),抑制滑膜炎癥,

13、提示BLyS和APRIL是AA滑膜炎癥過程中的重要調(diào)節(jié)因子。
　　5. TACI-Ig調(diào)節(jié)Th細(xì)胞平衡和異常的免疫功能,對(duì)AA大鼠有治療作用
　　TACI-Ig(0.7,2.1,6.3mg/kg, sc, d16~d34)明顯減輕AA大鼠繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù),減輕關(guān)節(jié)軟組織腫脹,改善關(guān)節(jié)和脾臟病理學(xué)損傷,對(duì) AA大鼠有治療作用。TACI-Ig明顯降低AA大鼠外周血和滑膜組織勻漿BLyS和APRIL水平;降低血清細(xì)胞因

14、子IL-1β、TNF-α和PGE2水平;降低免疫球蛋白IgM水平;調(diào)節(jié) Th1/Th2、Treg/Th17細(xì)胞比例的平衡;抑制脾臟 CD20(B細(xì)胞)、CD3(T細(xì)胞)和CD68(巨噬細(xì)胞)表達(dá)。TACI-Ig(0.7 mg/kg)升高外周血總(CD3+CD4+) T細(xì)胞比例,TACI-Ig(6.3 mg/kg)升高外周血總(CD3+CD4+)和記憶(CD4+CD44+) T細(xì)胞比例;TACI-Ig(0.7,2.1,6.3mg/kg)升

15、高脾臟總( CD3+CD4+)、活化(CD4+CD25+)和記憶(CD4+CD44+)T細(xì)胞比例。提示TACI-Ig調(diào)節(jié)Th細(xì)胞平衡和異常的免疫功能,對(duì)AA大鼠有治療作用。
　　結(jié)論:
　　1. AA大鼠外周血和脾臟中BLyS和APRIL表達(dá)異常升高,血清BLyS水平與關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重度以及病理學(xué)損傷密切相關(guān),提示BLyS和APRIL在大鼠AA中發(fā)揮重要作用;
　　2. AA大鼠滑膜組織中BLyS/APRIL受體表達(dá)異常,B