姜黃素抑制BLyS表達(dá)的分子機(jī)制及其在抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一常見(jiàn)的自身免疫性疾病，具有較高致殘率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。RA的發(fā)病機(jī)制不僅涉及T淋巴細(xì)胞活化，而且與B 淋巴細(xì)胞過(guò)度活化與功能亢進(jìn)有密切聯(lián)系，近年研究表明B 淋巴細(xì)胞在RA的防治中有重要作用。TNF家族的B 淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS)是主要表達(dá)于B 淋巴細(xì)胞的重要致炎細(xì)胞因子，其過(guò)表達(dá)與RA的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，

2、抑制BLyS表達(dá)或生物學(xué)活性的發(fā)揮，無(wú)疑有利于RA的防治。姜黃素(Curcumin)是姜黃色素中最重要的活性成分，研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用，在抗RA等自身免疫性疾病方面具有明顯的應(yīng)用前景，但其發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制尚未明了，特別是其抗RA的機(jī)制是否與調(diào)節(jié)BLyS 有關(guān)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，我們針對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了系列研究，探討了姜黃素對(duì)BLyS的調(diào)節(jié)作用及其在抗RA中的作用，結(jié)果表明，姜黃素可抑制基礎(chǔ)水平和

3、IFN-γ誘導(dǎo)的BLyS表達(dá)，而且在小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Collagen induced arthritis，CIA)模型中有抗炎作用并抑制體內(nèi)的BLyS表達(dá)，“通過(guò)抑制BLyS表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用”可能是姜黃素抗RA的一個(gè)新機(jī)制。
　　 第一部分姜黃素可抑制基礎(chǔ)水平BLyS的表達(dá)目的：以人B 淋巴細(xì)胞為模型，探討姜黃素對(duì)基礎(chǔ)水平BLyS表達(dá)的抑制作用，闡明該抑制作用的可能分子機(jī)制。
　　 方法及結(jié)果：
　　 1

4、.在人B 淋巴細(xì)胞Namalwa和Daudi中，經(jīng)RT-PCR及Real-time PCR 證實(shí)姜黃素可抑制基礎(chǔ)水平BLyS mRNA的表達(dá)；經(jīng)Western blot 證實(shí)姜黃素可抑制基礎(chǔ)水平BLyS蛋白的表達(dá)。
　　 2.構(gòu)建了包含不同長(zhǎng)度BLyS基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶(Luciferase，Luc)報(bào)告基因重組質(zhì)粒，經(jīng)Luc 報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素可抑制基礎(chǔ)水平BLyS基因啟動(dòng)子區(qū)的活性，且該抑制作用與-1082～-5

5、71區(qū)域密切相關(guān)。
　　 3.經(jīng)電泳遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoresis mobility shift，EMSA)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NF-κ B能特異性結(jié)合于BLyS基因啟動(dòng)子區(qū)?874～?858 序列，姜黃素呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性抑制NF-κ B與該區(qū)域的結(jié)合。
　　 4.經(jīng)染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素可在B 淋巴細(xì)胞內(nèi)抑制NF-κ

6、 B的p65 亞基與BLyS基因啟動(dòng)子區(qū)?874～?858 結(jié)合。
　　 5. 經(jīng)激光共聚焦、Western blot 證實(shí)，姜黃素可抑制p65 核轉(zhuǎn)位及I κ B α的磷酸化。
　　 結(jié)論：在人B 淋巴細(xì)胞Namalwa和Daudi中，姜黃素可抑制基礎(chǔ)水平BLyS的表達(dá)，該抑制作用的可能機(jī)制是其抑制了NF-κ B信號(hào)通路。
　　 第二部分姜黃素對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)BLyS表達(dá)的抑制作用目的：在人B 淋巴細(xì)胞細(xì)胞中，

7、探討姜黃素對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)BLyS表達(dá)的抑制作用，闡明該抑制作用的可能分子機(jī)制。
　　 方法及結(jié)果：
　　 1.在B 淋巴細(xì)胞Namalwa和Daudi中，經(jīng)RT-PCR、Real-time PCR及Western blot證實(shí)了姜黃素可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的BLyS表達(dá)。
　　 2.Luc 報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的BLyS基因啟動(dòng)子區(qū)活性。
　　 3.經(jīng)RT-PCR、Real-t

8、ime PCR及Western blot 證實(shí)，JAK2 抑制劑(AG 490)可阻斷IFN-γ對(duì)BLyS表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　 4.經(jīng)Western blot 證實(shí)，姜黃素可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的STAT1磷酸化。
　　 結(jié)論：在人B 淋巴細(xì)胞中，姜黃素可抑制IFN-γ誘導(dǎo)BLyS的表達(dá)，該抑制作用是由于抑制了JAK2-STAT1信號(hào)通路。
　　 第三部分姜黃素在小鼠CIA 模型中抑制BLyS的表達(dá)及抗炎作用目的

9、：建立用于RA 研究的小鼠CIA 模型，并探討姜黃素在該動(dòng)物模型上的抗炎作用以及抗炎過(guò)程中對(duì)BLyS表達(dá)的抑制作用，以揭示“通過(guò)抑制BLyS表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用”是姜黃素抗RA的一個(gè)新機(jī)制。方法及結(jié)果：
　　 1.將牛Ⅱ型膠原經(jīng)尾根部皮下注射于8周齡雄性DBA/1小鼠，制備小鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型。
　　 2.以關(guān)節(jié)炎指數(shù)對(duì)小鼠模型的炎癥情況進(jìn)行評(píng)分，證實(shí)了(1)姜黃素預(yù)處理后對(duì)CIA的炎癥有一定預(yù)防作用；(

10、2)在已建立的CIA 模型上，姜黃素處理對(duì)炎癥有治療作用。
　　 3.經(jīng)ELISA 檢測(cè)小鼠血清中炎性細(xì)胞因子BLyS、IFN-γ、IL-6水平，證實(shí)了姜黃素抗炎過(guò)程中可抑制上述炎性細(xì)胞因子的水平。
　　 4.經(jīng)RT-PCR及Western blot 證實(shí)了姜黃素在抗炎過(guò)程中可下調(diào)小鼠脾臟組織中BLyS的表達(dá)。
　　 結(jié)論：在小鼠CIA 模型中，姜黃素對(duì)關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程有預(yù)防及緩解作用，“通過(guò)抑制BLyS表達(dá)而發(fā)揮抗