鯊魚軟骨多糖的分離純化及其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。通過對(duì)RA的發(fā)病機(jī)制研究，抗炎治療已經(jīng)成為RA治療的一個(gè)重要原則。近年來，糖胺聚糖類藥物的抗炎作用的研究已有報(bào)道，本課題選擇了鯊魚軟骨中的糖胺聚糖的抗炎作用進(jìn)行研究。 鯊魚軟骨多糖主要包括硫酸角質(zhì)素(keratan sulfate，KS)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfatase，CS)和

2、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)等，均屬于糖胺聚糖類化合物。硫酸軟骨素A(CSA)和硫酸軟骨素C(CSC)都是由葡萄糖醛酸與硫酸化的N-乙酰氨基半乳糖通過B1→3糖苷鍵組成的二糖單位為主要重復(fù)雙糖單位，只是硫酸基的位置不同。雙糖之間通過B1→4糖苷鍵連接形成線形分子。硫酸角質(zhì)素由半乳糖與6-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖通過B1→4糖苷鍵組成的二糖單位為主要重復(fù)雙糖單位，雙糖之間通過B1→3糖苷鍵連接形成線形分子，它是鯊魚軟骨

3、多糖成分中唯一不含糖醛酸的糖胺聚糖。研究發(fā)現(xiàn)鯊魚軟骨多糖除了具有傳統(tǒng)的治療神經(jīng)痛、偏頭痛和抗腫瘤等活性外，還具有一定的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎功能。 本課題研究了各種鯊魚軟骨多糖對(duì)RA大鼠的治療作用，探討了各種鯊魚軟骨多糖對(duì)RA炎癥過程中的RatIL-6和Rat IL-12表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。此外，還研究了各種鯊魚軟骨多糖對(duì)明膠酶活性的影響。 1鯊魚軟骨多糖的分離和純化將精制的鯊魚軟骨多糖提取物經(jīng)Q Speharose

4、<'TM> Fast Flow強(qiáng)離子交換柱層析進(jìn)行分離，Sephadex G-15凝膠柱脫鹽后，獲得組成相對(duì)單一的組分，在醋酸纖維素薄膜電泳中顯示單一條帶。 2 鯊魚軟骨多糖的結(jié)構(gòu)分析 利用紅外光譜(IR)、核磁共振光譜(<'1>H-NMR、<'13>C-NMR)分析結(jié)果確定鯊魚軟骨多糖的主要分子結(jié)構(gòu)。紅外光譜結(jié)果顯示，SCP-3、SCP-4與SCP-5結(jié)構(gòu)中含有羥基、羰基和酰胺結(jié)構(gòu)，并含有硫酸基，且后兩者硫酸基含

5、量較高。而SCP-3中不含有羧基，其結(jié)構(gòu)中可能不含有糖醛酸，提示其可能為KS。SCP-1與SCP-2結(jié)構(gòu)中不含有硫酸基，可能為HA。 3 鯊魚軟骨多糖對(duì)Rat IL-6和Rat IL-12分泌的影響 建立大鼠RA模型，利用x線分析確定各組大鼠炎癥情況。結(jié)果顯示，SCP-3、SCP-4、SCP-5三種鯊魚軟骨多糖具有減輕炎癥反應(yīng)、降低大鼠足跖腫脹度的作用。研究了SCP-3、SCP-4、SCP-5三種鯊魚軟骨多糖對(duì)RA大

6、鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-12的影響，以及不同給藥濃度對(duì)RA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-12的影響。結(jié)果顯示，模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Rat IL-6含量為635.93±92.03 pg/mL，．明顯高于陰性對(duì)照組(367.84±57.66 pg/mL)(P<0.05)。三種鯊魚軟骨多糖用藥組Rat IL-6含量分別是SCP-3組：472.33±75.82 pg/mL；SCP-4組：434.4±

7、28.06 pg/mL；SCP-5組：440.07±36.79 pg/mL。其中SCP-4與SCP-5對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6分泌有顯著性抑制作用(P<0.05)，而SCP-3效果并不明顯(P>0.05)。 模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，Rat IL-12含量為222.73±19.42pg/mL，明顯高于陰性對(duì)照組(33.93±14.40 pg/mL)(P<0.05)。三種鯊魚軟骨多糖用藥組Rat IL-12含量分別是SCP-3

8、組：80.54±17.42 pg/mL SCP-4組：64.6±22.11 pg/mL；SCP-5組：65.18±15.54 pg/mL。其中SCP-4組和SCP-5組與模型組比較，具有顯著性差異(P<0.05)，而SCP．3組無顯著性差異(P<0.05)。 不同給藥濃度對(duì)RA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-12的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同SCP的給藥濃度對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中Rat IL-6、RatIL-12

9、的含量均有一定的影響。當(dāng)給藥濃度為250 μg/mL，時(shí)，各給藥組RatIL-6、Rat IL-12含量為最低。 4 鯊魚軟骨多糖對(duì)RatIL-6和Rat IL-12 mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響 采用RT-PCR對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞Rat IL-6和Rat IL-12 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。通過對(duì)內(nèi)參照g-actin和Rat IL-6、Rat IL-12退火溫度的摸索，確定其最佳退火溫度分別為54℃、61℃、56℃。在

10、反應(yīng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，比較了模型組、SCP-3組、SCP-4組、SCP-5組巨噬細(xì)胞中mRNA量的變化，結(jié)果顯示SCP-3、SCP-4和SCP-5給藥組的平均積分光密度值均小于模型組。其中以SCP-5給藥組的平均積分光密度值最小，說明三種SCP對(duì)Rat IL-6和Rat IL-12 mRNA轉(zhuǎn)錄均有一定的抑制作用，以SCP-5的抑制作用最顯著。 5 鯊魚軟骨多糖對(duì)明膠酶活性的影響 研究了鯊魚軟骨多糖對(duì)明膠酶活性的影響，結(jié)

11、果顯示，三種鯊魚軟骨多糖的抑制作用強(qiáng)弱依次為SCP-4>SCP.3>SCP.5，并且SCP-3、SCP-4、SCP-5對(duì)明膠酶活性的作用呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)濃度較高時(shí)(≥2 mg/mL)，三種多糖均表現(xiàn)出一定的促進(jìn)明膠酶活性的作用，低濃度時(shí)表現(xiàn)為抑制作用且隨濃度降低SCP-3、SCP-4抑制作用先升高再降低；當(dāng)濃度達(dá)到3.2×10<'-3>mg/mI時(shí)，抑制作用最強(qiáng)；當(dāng)濃度再降低時(shí)，其抑制作用減弱。SCP-5的抑制作用在0.4～2.56×

12、lO<'-5>mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨濃度的降低而升高。 本研究取得的主要成果有： (1)首次觀察了不同鯊魚軟骨多糖組分對(duì)RA發(fā)病中Rat IL-6、Rat IL-12活性的影響，以及對(duì)RatIL-6、RatIL-12 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果顯示，鯊魚軟骨 多糖對(duì)RA 模型大鼠中Rat IL-6、Rat IL-12活性和mRNA的表達(dá)具有抑制作 用，說明鯊魚軟骨多糖作用于RA發(fā)病過程中的不同環(huán)節(jié)。 (2)首