祛痹方對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的免疫性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及其機(jī)理探討.pdf

1、目的：
　　采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的免疫性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠為模型，探討祛痹方對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的治療作用及其機(jī)理，為中醫(yī)藥治療該病提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　選用SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取12只作為空白對(duì)照組，其余60只采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑的方法誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎模型。免疫15d以后，將60只CIA大鼠隨機(jī)分為4組，每組各15只：CIA模型組、雷公藤多苷組、祛

2、痹方高劑量組、祛痹方低劑量組。分組后開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)4周。各組給藥方法如下，祛痹方高劑量組：給藥劑量為6.66g/kg·d，給藥濃度為0.666g/ml；祛痹方低劑量組：給藥劑量為3.33g/kg·d，給藥濃度為0.333g/ml；雷公藤多苷組：給藥劑量為9.68mg/kg·d，給藥濃度為0.968mg/ml；給藥體積均為1ml/100g體重，空白對(duì)照組和模型組給予等體積純凈水。飼養(yǎng)期間觀察大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，并測(cè)量大鼠關(guān)節(jié)腫

3、脹度。治療4周后處死動(dòng)物，光鏡下觀察大鼠膝關(guān)節(jié)的病理損傷情況；采用ELISA方法測(cè)定大鼠血漿中抗Ⅱ型膠原抗體、IL-1β、IL-6的水平；采用比色法測(cè)定血漿中SOD、MDA和GSH-Px活性；采用免疫組化的方法檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)中的兩個(gè)受體fins樣酪氨酸激酶(fins-like tyrosine kinase，F(xiàn)LT-4)和胎肝激酶受體(kinase insert domain region，F(xiàn)LK-

4、1)，以及低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α)等因子的變化。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法：結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較，采用LSD法。
　　結(jié)果：
　　(1)關(guān)節(jié)損傷結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，免疫后15d大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著增加，而各組造模大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)無明顯差異。給藥后，與模型組比較，雷公藤多苷組和祛痹方組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)有

5、降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯高于空白對(duì)照組；與CIA模型組相比，雷公藤多苷組、祛痹方高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯降低，且祛痹方高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯低于雷公藤多苷組。
　　光鏡下可見明顯的滑膜細(xì)胞增生，排列紊亂，滑膜組織充血水腫，毛細(xì)血管增生，并可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；增生的滑膜組織形成絨毛狀，可伸向關(guān)節(jié)腔深處，或向軟骨面爬行形成血管翳。在血管翳覆蓋下的軟骨表層可見明顯的軟骨表層組織的變性、壞死。關(guān)節(jié)軟骨面剝

6、脫，可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)有脫剝的關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織。治療后滑膜細(xì)胞增生減輕，滑膜組織充血水腫明顯減輕，血管增生和浸潤(rùn)炎細(xì)胞數(shù)量減少，血管翳形成顯著減少。關(guān)節(jié)軟骨面可見少量扁平層剝脫，剝脫軟骨面平整，軟骨下骨的骨小梁大小、排列基本正常。與模型組比較，祛痹方高劑量組與雷公藤多苷組大鼠關(guān)節(jié)損傷均明顯減輕；祛痹方高劑量組與雷公藤多苷組相比，病理積分明顯降低。
　　(2)通過免疫組化檢測(cè)滑膜組織中VEGF的兩個(gè)受體FLT-4和FLK-1，結(jié)果表明：

7、與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)FLK-1、FLT-4水平明顯升高，而雷公藤多苷組和祛痹方高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)FLK-1、FLT-4水平較模型組明顯降低；且祛痹方高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)FLK-1、FIT-4較雷公藤多苷組比較明顯降低；祛痹方低劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)FLK-1、FLT-4水平有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIF-1α的檢測(cè)結(jié)果表明：與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)HIF-1α水平明顯升高，而雷公藤多苷組和祛痹方高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)HI

8、F-1α水平較模型組明顯降低；祛痹方低劑量組大鼠HIF-1α水平有下降趨勢(shì)，但亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3)采用ELISA方法檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子水平的結(jié)果表明：與空白對(duì)照組比較，CIA模型組大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體、IL-1β、IL-6水平明顯升高；雷公藤多苷組和祛痹方高劑量組大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體、IL-1β、IL-6水平較模型組明顯降低；祛痹方低劑量組大鼠血漿IL-1β水平明顯下降，抗Ⅱ型膠原抗體及IL-6水平與CIA模型組比較無

9、顯著性差異。與雷公藤多苷組比較，祛痹方高劑量組抗Ⅱ型膠原抗體、IL-1β含量明顯降低。
　　(4)采用比色法檢測(cè)血漿中GSH-Px、SOD和MDA活性的影響表明：與空白對(duì)照組比較，CIA模型組大鼠血漿GSH-Px、SOD活性明顯下降，MDA活性明顯升高。雷公藤多苷和高低劑量祛痹方均能使大鼠血漿GSH-Px活性明顯升高、MDA活性明顯下降，雷公藤多苷和高劑量祛痹方亦能使大鼠血漿SOD活性明顯升高。
　　結(jié)論：
　　(1)

10、祛痹方可以顯著減輕CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度和關(guān)節(jié)病理損傷程度，對(duì)CIA大鼠具有明顯的治療作用，其療效要優(yōu)于雷公藤多苷。
　　(2)祛痹方可以通過降低關(guān)節(jié)局部滑膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子中的兩個(gè)受體FLT-4和FLK-1以及HIF-1α蛋白的表達(dá)，從而抑制新生血管形成和滑膜細(xì)胞增生，改善關(guān)節(jié)滑膜炎性病變。
　　(3)祛痹方亦可以降低血漿中抗Ⅱ型膠原抗體水平，減少免疫復(fù)合物的形成，抑制CIA大鼠異常的自身免疫反應(yīng)，并通過下調(diào)血漿中