非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及免疫學(xué)機(jī)制探討.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、進(jìn)展性、自身免疫性疾病，以炎性細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑膜處浸潤(rùn)，滑膜增生，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨及骨的持續(xù)破壞為特征。由于RA病因未明，缺乏根本治療藥物，故成為世界性治療難題。因此探索RA的病理生理過程，研究治療RA的藥物越來越受到重視。非T細(xì)胞結(jié)合肽(NTAP)是處于研發(fā)階段的用于抗原介導(dǎo)、基因相關(guān)的全身性免疫疾病——類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。經(jīng)過數(shù)十年的研究，通過對(duì)系列先導(dǎo)化合

2、物的篩選而獲得。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型是具備細(xì)胞免疫和體液免疫兩種變化的慢性、系統(tǒng)性炎癥動(dòng)物模型，以多發(fā)性的末端關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制及臨床特征與RA最為相似，模型也較為穩(wěn)定，是目前國(guó)際上公認(rèn)的成熟的模型，被廣泛應(yīng)用于RA發(fā)病機(jī)制以及篩選治療RA藥物的研究。因此本研究擬建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，觀察非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用以及對(duì)大鼠血清中炎癥細(xì)

3、胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ及Ⅱ型膠原(CⅡ)抗體水平的調(diào)控作用，并檢測(cè)其對(duì)大鼠外周血T細(xì)胞分型的影響，探討非T細(xì)胞結(jié)合肽治療RA的免疫學(xué)機(jī)制，為非T細(xì)胞結(jié)合肽臨床用于治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用
　　目的:觀察非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。
　　方法:選擇6-7周齡的Lewis雌性大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和CIA模型組。CIA模型組大鼠于尾根部皮內(nèi)注

4、射牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑配制的乳劑，7天后同法加強(qiáng)免疫1次。成模大鼠隨機(jī)分為模型組、非T細(xì)胞結(jié)合肽低劑量組(0.25mg/kg)、非T細(xì)胞結(jié)合肽中劑量組(0.5mg/kg)、非T細(xì)胞結(jié)合肽高劑量組(1.0mg/kg)和甲氨蝶呤組(0.5 mg/kg)，每組動(dòng)物至少8只。非T細(xì)胞結(jié)合肽低、中、高劑量組尾靜脈注射給藥，隔日給藥一次。模型組和空白對(duì)照組以相同方法和體積注射PBS。甲氨蝶呤組腹腔注射，每周兩次，各組大鼠按0.5 mL/100

5、 g的體積給予相應(yīng)藥物，治療三周。造模后隔日對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)行評(píng)分。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ及Ⅱ型膠原抗體的水平。對(duì)踝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，觀察關(guān)節(jié)的病理變化。
　　結(jié)果:
　　1、炎癥評(píng)分的變化
　　隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，除空白對(duì)照組，各組大鼠關(guān)節(jié)紅腫逐漸加重，關(guān)節(jié)炎評(píng)分逐漸增高。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的炎癥評(píng)分明顯升高(P＜0.05)。與模型組比較，非T細(xì)

6、胞結(jié)合肽低劑量組的炎癥評(píng)分有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;非T細(xì)胞結(jié)合肽中、高劑量組的炎癥評(píng)分明顯降低(P＜0.01);甲氨蝶呤組的炎癥評(píng)分明顯降低(P＜0.01)。
　　2、血清細(xì)胞因子及Ⅱ型膠原抗體水平變化
　　與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ、CⅡ抗體水平明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，非T細(xì)胞結(jié)合肽高劑量組血清中的TNF-α、IL-6、IFN-γ、CⅡ抗體水平明顯降低(P＜0.01或

7、P＜0.05);甲氨蝶呤組大鼠血清中的TNF-α、IL-6明顯降低(P＜0.05);非T細(xì)胞結(jié)合肽中劑量組大鼠血清中的IFN-γ明顯降低(P＜0.05)。
　　3、組織病理學(xué)變化
　　空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯病變。模型組大鼠滑膜細(xì)胞增生，滑膜組織中有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜襯里層增厚，骨與關(guān)節(jié)軟骨組織有明顯損傷。給藥組大鼠病理損傷較模型組明顯輕。
　　結(jié)論:采用牛Ⅱ型膠原免疫大

8、鼠成功的復(fù)制了類似人類RA的病理模型，觀察非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用。結(jié)果表明非T細(xì)胞結(jié)合肽可以明顯減輕CIA大鼠發(fā)病關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)程度、抑制后期骨損傷和骨破壞，非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)CIA大鼠有很好的治療效果，并且呈現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系。
　　第二部分非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)T細(xì)胞亞群分化的影響
　　目的:觀察非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血中T細(xì)胞亞群分化的影響。
　　方法:選擇6-7周齡的Lewis雌性大

9、鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和CIA模型組。CIA模型組大鼠于尾根部皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑配制的乳劑，7天后同法加強(qiáng)免疫1次。成模大鼠隨機(jī)分為模型組、非T細(xì)胞結(jié)合肽組，每組動(dòng)物至少8只。給藥方式分為:單次給藥和多次給藥，給藥劑量為1mg/kg，尾靜脈注射給藥。單次給藥后，各組大鼠分別于給藥2h、48 h、96 h和144 h眼眶內(nèi)眥靜脈取血，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血中Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞的比例。然后在上述大鼠炎癥

10、評(píng)分最高時(shí)進(jìn)行多次給藥，給藥方法同單次給藥，時(shí)間為隔天一次，連續(xù)兩周，給藥結(jié)束后144 h，處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定外周血Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞水平。模型組和空白對(duì)照組以相同方法和體積注射PBS。給藥期間對(duì)各組大鼠進(jìn)行炎癥評(píng)分。
　　結(jié)果:
　　1、炎癥評(píng)分的變化
　　與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的炎癥評(píng)分均明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，非T細(xì)胞結(jié)合肽單次給藥組大鼠炎癥評(píng)分有所下降，但是無

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;非T細(xì)胞結(jié)合肽多次給藥大鼠炎癥評(píng)分明顯降低，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　2、外周血T細(xì)胞亞群分化的變化
　　與空白對(duì)照組比較，模型組Th1、Th17細(xì)胞比例升高，Th2、Treg細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，非T細(xì)胞結(jié)合肽組Th1、Th17細(xì)胞比例明顯降低，Th2、Treg細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　非T細(xì)胞結(jié)合肽可減輕及延緩