重組人內(nèi)抑素誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：進(jìn)一步明確重組人內(nèi)抑素 (recombinant human endostatin，rh-End) 對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠繼發(fā)性炎癥的治療作用；從滑膜細(xì)胞增殖與凋亡、滑膜細(xì)胞分泌功能、新生血管生成等方面，研究rh-End對AA大鼠治療作用可能的環(huán)節(jié)；闡明rh-End抑制AA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS) 異常增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，分

2、析rh-End誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法：大鼠左側(cè)后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑 (Complete Freund′s Adjuvant，CFA)0.1ml 致炎，造成佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，rh-End(1.25、2.5、5.0mg·kg<'-1>·d<'-1>)皮下注射給藥，觀察大鼠全身狀況，足容積法測量繼發(fā)側(cè)足腫脹度，進(jìn)行多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分，光學(xué)顯微鏡觀察關(guān)節(jié)病理變化；膠原酶．胰蛋白酶消化法、組織塊移植法分離培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，光鏡

3、、透射電鏡分析滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，MTT法檢測滑膜成纖維細(xì)胞的增殖反應(yīng)；瓊脂糖凝膠電泳、TUNEL染色及Annexin V/PI雙染色法觀察成纖維滑膜細(xì)胞的凋亡；放免法檢測IL-1β 13、TNF-α含量；實(shí)時熒光定量PCR檢測VEGF mRNA、PDGF mRNA、FGF mRNA及TNF-α mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1．rh-End對AA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病理的影響 AA大鼠致敏后10d左右出現(xiàn)炎癥反

4、應(yīng)，多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)較高，表現(xiàn)為對側(cè)和前肢足爪腫脹，耳、尾出現(xiàn)炎性結(jié)節(jié)和紅斑并伴有體重下降。與正常大鼠相比，光鏡下可見AA模型組大鼠的滑膜組織中滑膜細(xì)胞增生明顯，炎性細(xì)胞浸潤及血管翳形成，軟骨中炎性細(xì)胞浸潤，破壞軟骨組織，同時還可見滑膜細(xì)胞的脂肪變性。rh-End治療組可不同程度改善以上變化。 2.rh-End對AA大鼠滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的影響 AA大鼠表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞增殖功能亢進(jìn)，rh-End(1.25、2.5、5.0m

5、g·kg<'-1>) 體內(nèi)治療給藥及rh-End 6.25～50 μg·ml<'-1>濃度范圍體外給藥可顯著抑制 AA 大鼠成纖維細(xì)胞的增殖反應(yīng)。rh-End體內(nèi)用藥可誘導(dǎo)AA大鼠滑膜組織及細(xì)胞的凋亡，rh-End體外用藥作用48h，Annexin V/PI雙染色法觀察到AA FLS凋亡率為3.32％，rh-End(25mg·L<'-1>)可誘導(dǎo)AA FLS的凋亡，其凋亡率為6.67％，說明異常增生的滑膜細(xì)胞可能是rh-End的另一個作

6、用靶點(diǎn)。結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，表明rh-End可能通過抑制滑膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡從而起到對AA大鼠滑膜炎的治療作用。 3.rh-End對AA大鼠滑膜細(xì)胞分泌功能的影響 rh-End治療給藥可糾正AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變：A型滑膜細(xì)胞線粒體和空泡顯著增多，線粒體腫脹、嵴突破壞或消失；B型滑膜細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著增加，網(wǎng)池顯著膨脹及結(jié)構(gòu)破壞，致密體數(shù)量顯著增加。rh-End(1.25、2.5、5.0mg·kg<'-1>)均

7、可不同程度抑制AA大鼠滑膜細(xì)胞的IL-1α、TNF-α含量；rh-End可降低AA大鼠滑膜組織TNF-α mRNA表達(dá)水平，顯著抑制AA大鼠滑膜細(xì)胞分泌TNF-α，表明rh-End減輕滑膜細(xì)胞亢進(jìn)的分泌功能是其保護(hù)軟骨的重要方面。 4.rh-End對AA大鼠滑膜組織促血管生成因子mRNA基因表達(dá)的影響 rh-End體內(nèi)給藥可明顯降低AA大鼠滑膜組織中PDGF、FGF以及VEGFmRNA基因的高表達(dá)水平，提示rh-End能

8、對抗PDGF、FGF、VEGF 等新生血管生成刺激因子的促血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，抑制新生血管生成，從而抑制滑膜血管翳的侵蝕性，減輕AA的滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞。 結(jié)論： 1．rh-End對大鼠AA多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)局部腫脹及病理形態(tài)等具有明顯的改善作用，且rh-End可不同程度抑制FLS亢進(jìn)的增殖反應(yīng)，同時誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生，減輕AA大鼠增生性滑膜炎。 2．rh-End可保護(hù)滑膜細(xì)胞具有分泌功能細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，減輕AA大